lyao222lll的个人博客分享 http://blog.sciencenet.cn/u/lyao222lll

博文

J HEPATOL:基因组测序鉴定WNK2为肝细胞癌发生和早期复发的风险基因

已有 633 次阅读 2019-9-7 10:54 |个人分类:肿瘤基因组|系统分类:论文交流| _肿瘤基因组

Genomic Sequencing Identifies WNK2 as a Driver in hepatocellular carcinoma and a Risk Factor for Early Recurrence

基因组测序鉴定WNK2为肝细胞癌发生和早期复发的风险基因

 

期刊:Journal of Hepatology

发表单位:复旦大学附属中山医院 

Published online23 July 2019

文献链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168827819304234

 

虽说将基因组测序用于肝癌的研究已经不是什么新鲜事,本研究则重点关注中国肝癌患者的愈后早期复发现象,且建立在大样本量的基础上,算是迄今为止最全面的对中国肝癌患者愈后早期复发的基因组特征描述。当然只测序肯定不行,对于关键驱动基因WNK2的验证,文章中同样通过一系列的细胞生化试验将基因功能阐述的非常透彻(一半以上的篇幅)。

 


摘要


肝细胞癌(HCC)切除术后的早期复发很常见,然而遗传机制与HCC早期复发之间的关联仍然未知,特别是在中国患者中。本研究对中国HCC患者进行了深入的基因组分析,鉴定了5个与术后早期肿瘤复发相关的基因(WNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53),其中WNK2是主要的风险基因。WNK2的体细胞突变和拷贝数丢失与其表达水平的降低、患者较高的肿瘤早期复发率和较短的整体存活率相关。功能研究证实WNK2具有肿瘤抑制作用,其失活导致HCC细胞中ERK1/2信号传导活化,肿瘤相关巨噬细胞侵袭以及肿瘤的生长和转移。本研究结果全面描绘了中国HCC患者的突变景观,并鉴定WNK2为术后肿瘤早期复发相关的关键驱动因子。

 


前言


肝细胞癌(HCC)是一种相对常见的癌症,中国每年发病率和死亡率大约占全球患者的一半,并且仍在上升。在中国,大多数HCC患者由乙型肝炎所致,其他风险因素如黄曲霉毒素和马兜铃酸等也是HCC的一大成因。这些病因可能导致中国患者的肿瘤细胞的基因变异特征显著区别于其他国家和地区的患者。

随着技术的进步,HCC的发病机制正在逐步被揭示,一些研究已经描绘了肝癌发生的遗传全景,如染色体6p21VEGFA)、11q13FGF19/CNND1)上存在的扩增,染色体9上存在的缺失(CDKN2A)等。TP53CTNNB1编码区的突变影响25-30%的HCC患者,以及一些低频突变的其它基因(如AXIN1ARID2ARID1ATSC1/TSC2等),鉴定了在HCC中通常失调的核心途径。许多与HCC相关的基因组变异已在西方和日本人群中得到表征,然而在中国人群中的研究尚少。为了全面了解HCC的分子病因,必须更多地了解中国人群中与HCC相关的基因组变异。

HCC治疗方法的进步提升了患者的存活率,然而仍然具有较高的早期复发率。HCC患者的遗传机制与早期复发之间的关联仍然未知,特别对于中国患者而言。本研究的目的在于系统地描述中国HCC患者的基因组变异全景,并鉴定患者中与肿瘤早期复发相关的变异。

 


材料方法


本研究对切除术后肿瘤早期复发的67例中国HCC患者中的49例进行了全基因组测序(WGS),18例进行了全外显子组测序(WES),包括成对的肿瘤和正常组织。挑选了97个重要的基因,对115个另外的HCC样本及其配对的正常组织进行了靶向测序(包含34例早期复发的患者和81例未早期复发的患者)。通过以上182例成对样本,本研究详细描述了中国HCC患者的基因组变异全景,并通过比较存在肿瘤早期复发的患者和未存在早期复发的患者之间特定基因的体细胞突变和拷贝数变异特征,鉴定风险基因。

0.png

对于WNK2基因(研究中所鉴定到的中国HCC患者中与肿瘤发生和术后复发相关的基因,详见正文),在研究中所涉及的所有736例患者中通过Sanger测序和qPCR分别验证该基因的突变位点并评估拷贝数。后续探讨了WNK2突变、拷贝数和表达量的变化与肿瘤早期复发和患者临床特征的关系,并结合分子细胞试验生化深入研究了WNK2对肿瘤生长和转移的功能作用机制。

材料方法的更细节信息请参见原文。

 


结论



1 原发性HCC早期复发患者的基因组变异总览


为了探究中国HCC患者在切除术后早期肿瘤复发的基因组变异,研究人员对49HCC患者(所有患者均复发肿瘤)的肿瘤和正常组织进行WGS测序,肿瘤组织的平均测序深度为54.5×,正常组织的平均测序深度为36.1×。通过比对人参考基因组(hg19)共检测到1662031个体细胞单核苷酸变异(SNV)和36684个插入/缺失(InDel)位点,每个肿瘤样本2446-99031个突变,平均每Mb存在6.52个(范围: 0.82-33.01)体细胞突变,并将突变率>10/Mb7HCC样本(14.3%的样本)定义为高突变。

关注碱基替换模式,C>A颠换、C>TT>C转换在所有HCC样本中普遍存在。7个超突变HCC样本中的6个具有显性T>A颠换,剩余的1个具有显性C>G颠换,并且所有HCC样本中T>A颠换与体细胞SNV的总数显著相关,暗示这些碱基突变与HCC的超突变存在关联。

研究人员通过碱基替换模式的突变特征分析,在HCC中鉴定了5种特征。特征A在于显性T>A突变,与COSMIC的特征22高度相似(余弦相似性= 0.98),其由马兜铃酸导致并且与高突变负荷相关。特征A是超突变HCC样本中的主要标记,并且与所有49HCC样本中体细胞SNV的总数显著相关。以C>G突变为代表的特征B仅在一个样本中占优势,其为49HCC样本中具有最高SNV数量的样本,它代表新的突变特征。以C>A为代表的特征C,与COSMIC的特征24高度相似(余弦相似性= 0.92),与黄曲霉毒素有关。特征DE的主要特征是C>TT>C突变,分别与COSMIC的特征5(余弦相似性= 0.84)和特征16(余弦相似性= 0.91)相似,已被揭示与衰老和乙醇消耗有关。

研究人员鉴定到32个扩增的区段,其中包含几个已知的癌基因,如CCND1TERTMYC18个丢失的区段,其涉及肿瘤抑制因子,包括TP5317p13)、RB113q14)和CDKN2A9q21)。同时还检测到丰富的基因组结构变异(SVs),每个样本平均43.4 SVs(范围= 0-224),共计483个缺失,18个倒位缺失,189个插入缺失,414个串联重复,3个插入和1019个染色体易位。研究人员还在26个(53%)的HCC样本中检测到HBV整合,并在TERT(一种HCC驱动基因)上发现了复发性HBV整合事件,以及在HCC样本中鉴定到CCNE1上游的HBV插入,其与肿瘤的侵袭性有关。

1.png

149HCC患者的肿瘤细胞基因组特征。(A)患者的基因组突变负荷,突变率>10/Mb7例(占所有病例的14.3%)被归类为高突变;(B)患者的基因组碱基替换模式;(C)患者的基因组突变频谱特征;(DABCDE5种突变频谱特征模式,同时标明其最相似的COSMIC特征;(EGISTIC分析揭示了拷贝数变异(CNV)的全基因组分布;(F)患者的染色体结构变异(SV)分布,包括插入、倒位、串联重复、缺失、染色体间和染色体内易位等。

 

2 HCC切除术后早期复发相关的WNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53体细胞突变的鉴定


研究人员结合分析18WES(平均测序深度:肿瘤113.7×,正常组织110.9×)和49WGS鉴定体细胞SNVInDel,得到10个显著突变的基因,其中6个(TP53AXIN1CTNNB1CDKN1AALBARID1A)在先前的研究中已被鉴定为潜在的癌症驱动因子。

使用来自182HCC样本的测序结果(49WGS18WES115对靶向测序,一对=肿瘤组织+正常组织),研究人员比较了存在肿瘤早期复发的患者和未存在早期复发的患者之间特定基因的体细胞突变频率,结果发现WNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53存在显著差异,其中WNK2最为显著。通过观察这5个基因突变在患者中的组合,研究人员发现伴随着突变基因数量增加的同时,肿瘤早期复概率随之增加,患者生存率随之下降。

2.png

2182例原发性HCC患者中术后肿瘤早期复发的基因突变。(A)具有或不具有肿瘤早期复发的HCC患者中,通过WGSWES以及靶向测序鉴定的基因组突变谱,图中显示了≥5个样品中存在突变的基因;(B)携带WNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53突变数量组合的患者比例;(C)携带不同突变基因数量(WNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53)的HCC患者的肿瘤早期复发率;(DWNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53突变数量和患者累积复发率和总体存活率的关系。

 

3 WNK2的体细胞突变、拷贝数丢失和表达降低可预测术后肿瘤早期复发


通过本研究包括的所有736HCC病例,研究人员在39名患者中确定了40WNK2体细胞突变:存在肿瘤早期复发的218例患者中的29例(13.3%),未存在肿瘤早期复发的518例患者中的10例(1.9%)。Polyphen-2分析显示,大多数突变能够对WNK2蛋白的功能产生不利影响。

WNK2位于染色体9qchr934399801-141213431)的大基因组区域内,49WGS分析结果显示该基因存在反复缺失。通过qPCR评估所有736HCC病例中WNK2的拷贝数,结果显示27.2%的患者(200/736,计算的拷贝数:0.13-0.99)中存在WNK2拷贝数丢失。

研究人员通过免疫组化在所有736HCC病例中进一步评估了WNK2的表达,结果显示,与正常组织相比,肿瘤组织中WNK2表达下调。具有WNK2体细胞突变或拷贝数丢失的患者显示肿瘤WNK2表达水平的显著降低。

随后研究人员对WNK2体细胞突变、拷贝数丢失和表达水平与患者的临床特征作了关联,发现它们与肿瘤体积增大、肿瘤数量增加、血管侵犯、卫星病灶、肿瘤分化和TNM分期增加等相关。在736HCC患者中,具有WNK2体细胞突变、拷贝数丢失或表达降低的患者与不具有这些特征的患者相比,出现更多的肿瘤早期复发,累积复发率更高且生存率降低。

3.png

3736HCC患者的WNK2变异和临床特征的关系。(A)本研究中鉴定的WNK2体细胞突变的分布;(BWNK3的结构模型示意图;(C736HCC患者的WNK2拷贝数;(D)免疫组化结果,WNK2野生型和突变体型肿瘤组织中WNK2染色;(E)不同组中WNK2染色密度的统计;(F)不同组中 HCC患者的早期复发率;(G)与其他临床参数相比,WNK2突变、拷贝数变异和表达水平更具有预测肿瘤早期复发的特征;(HWNK2突变、拷贝数变异和表达水平与患者累积复发率和总体存活率的关系。

 

4 HCCWNK2具有肿瘤抑制基因的功能


上述结果均表明WNK2HCC中可能具有抑制肿瘤的功能。为了证实该假设,研究人员分析了6HCC细胞系的WNK2的表达水平。qPCR显示具有高转移性特征的HCC细胞系(MHCC97LMHCC97HHCCLM3)中存在WNK2拷贝数丢失。Western印迹证实,与未转化的肝细胞系L0-2相比,6种已建立的HCC细胞系中WNK2蛋白水平降低,特别是在那些具有高转移潜能的HCC细胞系中。

研究人员在HepG2Hep3B细胞中敲低了WNK2,发现WNK2的敲低促进了HCC细胞增殖和细胞集落的形成,并且增强了其侵袭能力。HCC小鼠模型显示WNK2的敲低加速了肿瘤的生长和转移。类似地,在HCCLM3MHCC97H细胞中过表达WNK2,结果显示WT WNK2的过表达显著抑制了HCC的细胞增殖、集落形成及其侵袭能力,HCC小鼠模型显示WT WNK2的过表达显著抑制了肿瘤生长和转移。此外,研究人员还发现无义突变体WNK2 K211X和移码突变体WNK2 T275fs几乎丧失了对HCC细胞的抑制作用,这表明蛋白激酶结构域中的截短突变破坏了WNK2的功能。

总之,以上结果均有效支持了WNK2具有HCC肿瘤抑制基因的功能。

4.png

4,验证WNK2HCC肿瘤抑制功能。(A)在一个正常肝细胞系(L0-2)和六个HCC细胞系中,通过qPCR检测WNK2的拷贝数,并通过Western印迹检测WNK2的表达;(B)与对照相比,WNK2敲低显著增强了HepG2细胞的增殖;(C)与对照相比,WNK2敲低显著增强了HepG2细胞的集落形成;(D)与对照相比,WNK2敲低显著增强了HepG2细胞的侵袭能力;(E)小鼠模型中,肝肿瘤和肺转移肿瘤的生物发光图像,以及肺中转移瘤的HE染色图像,色标条代表了光子通量。

 

5 WNK2的失活激活了HCC细胞中ERK1/2信号传导


研究人员使用磷酸激酶阵列以及改变了WNK2表达水平的HCC细胞,研究了HCC细胞中WNK2的功能机制。结果显示,敲低WNK2HepG2细胞中p-ERK1/2上调超过100%;WNK2过表达后HCCLM3细胞中p-ERK1/2下调超过50%。蛋白印迹分析验证了这些结果,同时与WT WNK2相比,MT WNK2未能抑制ERK1/2信号传导,表明WNK2负调节ERK1/2信号传导,其突变或下调能够激活HCC细胞中的ERK1/2信号传导途径。HCC小鼠模型的肿瘤切片的免疫组化也显示出一致的结果。免疫组化同样揭示具有WNK2体细胞突变或拷贝数丢失的临床HCC病例存在更高的p-ERK1/2水平,进一步证实WNK2失活激活HCC中的ERK1/2信号传导。此外,U0126(一种MEK1/2抑制剂)治疗能够显著缓解HCC细胞增殖、集落形成及其侵袭能力。这些结果均表明WNK2 失活通过ERK1/2信号传导加速了HCC细胞的增殖和转移。

5.png

5WNK2失活导致HCC细胞中ERK1/2信号传导激活。(A)通过探测人磷酸激酶阵列筛选改变了WNK2表达水平的HCC细胞中的信号传导途径;(B)蛋白印迹证实了在改变了WNK2表达水平的HCC细胞中p-ERK1/2的表达;(C)源自不同HCC细胞衍生的小鼠模型的肿瘤切片的代表性p-ERK1/2染色,色标条表示各组的WNK2染色密度;(DHCC患者肿瘤样本切片的代表性p-ERK1/2染色,色标条表示WNK2染色密度;(EHepG2细胞和HCCLM3细胞经过U0126处理后细胞增殖的比较;(FHepG2细胞和HCCLM3细胞经过U0126处理后细胞集落的比较;(GHepG2细胞和HCCLM3细胞经过U0126处理后细胞侵袭能力的比较;(H)小鼠肝肿瘤和肺转移肿瘤的生物发光图像,色标条代表了光子通量。

 

6 WNK2失活导致肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的浸润


为了进一步探究WNK2对肿瘤微环境调节的影响,研究人员通过PCR阵列量化受HCC细胞WNK2表达影响的细胞因子和趋化因子的表达。研究中鉴定了3种细胞因子,集落刺激因子1CSF1)、CC基序趋化因子配体5CCL5)和转化生长因子β2TGFβ2),它们在WNK2敲低后(HepG2细胞中)上调超过100%并且在WNK2过表达后(HCCLM3细胞)下调超过100%,并通过蛋白印迹验证了这些结果。与WT WNK2相比,MT WNK2丧失了抑制这些细胞因子的能力。

鉴于CSF1CCL5TGFβ2在巨噬细胞的活化、趋化性和功能中发挥重要作用,研究人员随后评估了小鼠模型和HCC患者肿瘤中TAM的浸润。在敲低WNK2HepG2衍生肿瘤中,TAM的数量显著增加;在HCCLM3衍生肿瘤中,WT WNK2的过表达显著降低了TAM数量,而MT WNK2的过表达仅能部分抑制TAM的浸润。在HCC的患者中,WT WNK2患者具有相对较低的CSF1CCL5TGFβ2表达水平并且表现出较少浸润的TAM;而具有WNK2体细胞突变或拷贝数丢失的患者,则表现出较高的细胞因子表达水平和更多浸润的TAM。考虑到WNK2失活导致HCC细胞中ERK1/2信号传导激活,研究人员在使用U0126处理HCCLM3HepG2-shRNA-WNK2细胞后,观察到细胞因子/趋化因子的表达水平显著降低以及浸润TAM数量的显著减少,表明WNK2失活能够促进特异性细胞因子/趋化因子的表达并通过ERK1/2信号传导诱导TAM浸润。

6.png

6WNK2失活导致HCC小鼠模型和HCC患者中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的浸润。(A)维恩图显示了在HCC细胞中WNK2表达后鉴定的细胞因子数目改变,基于两组分析:(1shWNK2处理后HepG2细胞中上调的细胞因子,(2wild-type WNK2处理后HCCLM3细胞中下调的细胞因子;(BWestern印迹验证了CSF1CCL5TGFβ2在亲本和稳定转染的细胞中的表达;(C)不同HCC细胞衍生的小鼠模型的肿瘤切片中的代表性F4/80染色,色标柱表示了每组中F4/80阳性细胞数;(D736HCC患者肿瘤切片中的代表性CSF1CCL5TGFβ2CD68染色,色标条表示了每组中的染色密度和CD68阳性细胞数;(FU0126处理后,不同HCC细胞衍生的小鼠模型的肿瘤切片中的代表性F4/80染色,色标条表示每组中F4/80阳性细胞数。

 


讨论


本研究是迄今为止最全面的对中国HCC患者在肿瘤切除术后早期复发的基因组特征描述。研究通过对49例中国HCC患者进行WGS测序描绘基因组变异景观,包括体细胞SNVInDelCNVSVs,发现具有比其他HCC队列更高的突变负荷。WGS队列基于患有肿瘤早期复发的HCC患者,并且较高的突变负荷与几种类型癌症的预后不良相关。研究中通过突变频谱分析鉴定了5个突出的特征,其中特征A(马兜铃酸)和特征C(黄曲霉毒素)是34.7%(17/49)患者的主要特征,这与其他HCC队列研究不同。马兜铃酸或黄曲霉毒素是HCC发生的重要危险环境因素,并且已知会导致癌症的高变,特别是发生在中国人群中(饮食习惯等)。已证实,具有显性特征A或特征C的中国HCC患者具有比没有这些特征的患者更高的突变负荷。

切除术后HCC的复发可分为早期(发生在数周或数月内)和晚期(发生在切除后2年以上),其中早期复发占所有复发性HCC的近70%,并且主要归因于在治疗区域外发生的微转移。在该项研究中,通过WGSWES182HCC样本的靶向测序,发现基因WNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53中的突变与肿瘤早期复发相关。研究结果表明,在中国人群中,WNK2RUNX1T1CTNNB1TSC1TP53可能在HCC的侵袭和转移中发挥着作用。

在这些与术后肿瘤早期复发相关的基因中,WNK2具有最显著的突变频率差异。本研究发现在中国HCC患者中超过一半的WNK2突变为T>A/A>T颠换和C>A/G>T颠换,分别对应了前述特征A(马兜铃酸)和特征 C(黄曲霉毒素),推断这可能是导致与其他HCC队列相比,中国患者中WNK2突变出现更高频率的原因。

由于WNK2在癌症中的遗传机制和功能仍然未知,本研究随后展开了对WNK2功能的详细探究,并揭示了WNK2HCC中发挥肿瘤抑制作用。WNK2体细胞突变、拷贝数丢失和表达量下调与患者肿瘤早期复发和更低的生存率显著相关。WNK2的失活促进了HCC细胞的生长和转移,激活ERK1/2途径,诱导CSF1CCL5TGFβ2表达,促进TAM浸润,这些特征均证实WNK2HCC的驱动基因。

总结,本研究结果详细描述了中国HCC患者的基因组特征,并鉴定WNK2HCC的驱动基因,且其与术后肿瘤早期复发有关。

 



http://blog.sciencenet.cn/blog-3406804-1197005.html

上一篇:Nat Commun:多区域测序揭示了食管鳞状细胞癌的新靶向位点以及空间异质性
下一篇:JNCI:全外显子组测序研究遗传性黑色素瘤罕见的变异

0

该博文允许注册用户评论 请点击登录 评论 (0 个评论)

数据加载中...

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备14006957 )

GMT+8, 2019-10-19 05:13

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部