肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是实体瘤中宿主来源的主要成分，TAM通过几个方面参与肿瘤进展，包括血管生成、免疫抑制、癌细胞的血管入侵和转移，巨噬细胞的消除可以通过破坏血管生成和肿瘤转移来延缓肿瘤的进展。但是，巨噬细胞来源的EV在肿瘤中参与不同细胞类型间的通讯潜力尚未得到很好的研究。

6月4日，国际学术期刊Cell Reports在线发表了题为Molecular Profiling and Functional Analysis of Macrophage-Derived Tumor Extracellular Vesicles 的研究论文。Cianciaruso等运用蛋白质组学等技术分析了小鼠肿瘤中巨噬细胞分泌胞外囊泡(TAM-EVs)的方法，以及它们对癌症细胞和T细胞的影响。

结果表明与源TAMs相比，TAM-EV与具有Th1/M1极化有关的分子特征，增强炎症增强和免疫反应，更有利的病人预后。TAM-EVs还含有生物活性脂质和生物合成酶，这可能改变癌细胞的促炎信号。因此，尽管TAMs在很大程度上是免疫抑制的，但它们的EV有可能刺激而不是限制抗肿瘤免疫。

研究精读

1. 从IgG-和抗CSF1R治疗小鼠MC38肿瘤中分离EV

研究者对完整的和巨噬细胞缺失的MC38肿瘤进行比较分析，作为研究TAMs衍生的EV的模型。由于缺乏直接从肿瘤中分离巨噬细胞来源的EV的方法，大多数研究都是从培养的巨噬细胞中纯化EV。首先建立了研究小鼠肿瘤中巨噬细胞分泌胞外囊泡(TAM-EVs)的方法，并通过CSF1R阻断消除因TAM导致的结直肠肿瘤的TAM-EV的富集差异。

作者使用巨噬细胞丰富的MC38结直肠肿瘤分离TAM衍生的EV，在C57BL/6小鼠皮下接种了MC38细胞，用同型匹配的免疫球蛋白G (IgG)或抗CSF1R处理带有MC38肿瘤的小鼠，有效清除M2样(MRC1+)和M1样(CD11c+或MHCII+)TAMs，并通过连续离心、高速超离心分离并富集EV，最终通过密度梯度离心进一步提高纯度。

 图1 从IgG-和抗CSF1R治疗小鼠MC38肿瘤中分离EV

2. 差异蛋白质组学鉴定TAM-EV的蛋白表达谱

作者随后运用定量蛋白质组学检测分离的两种外泌体（IgG-EVs和Anti-CSF1R-EVs），分析其中差异表达的蛋白（以将平均变化倍数>1.7为阈值）。GO富集分析表明，蔗糖密度梯度离心前的EV富含RNA相关蛋白，而分梯度离心分离后的EV富含免疫反应，脂质代谢和囊泡运输蛋白(图2A)。这些结果表明，分离肿瘤EV应先连续离心，再进行密度离心分离。

 图2. EV蛋白的富集与相互作用分析

对肿瘤来源的EV进行分析发现，抗CSF1R的治疗后，81种蛋白(TAM -EV蛋白)出现表达量下调（FC>1.7）。根据Immuno-Navigator数据库，许多差异蛋白质与巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞共表达基因对应(图2 B)。STRING数据库分析了与巨噬细胞生物学、toll样受体(TLR)信号传导，补体级联，脂质代谢，信号转导，细胞粘附，免疫反应和炎症蛋白之间的相互作用(图2C)。

3. TAM-EVs的免疫调节特性及功能

作者用流式细胞仪分离IgG-和抗CSF1R治疗的MC38肿瘤CD11b+细胞，并进行LC-MS/MS检测，结合TAMs基因表达数据以确定TAM细胞和TAM-EVs的蛋白表现出M1样还是M2样特征。结果表明TAM-EVs显示类似M1样TAM的特性，并促进T细胞增殖和活化，而且TAM-EV与临床疗效的好坏密切相关，并能提高存活率。

图3. TAM-EVs的免疫调节特性及功能

此外，作者同时对IgG或抗CSF1R治疗的整个MC38肿瘤进行了脂质体分析。结果表明由COX酶合成的几种前列腺素PGs及其代谢物(包括PGF2a、PGE1、PGE2)，在TAM缺失肿瘤中显著升高(图4G)，前列腺素PGs抑制CD8+ T细胞活化的能力(图4H)。与Anti-CSF1R-EVs相比，IgG-EVs刺激了MC38的产生较高水平的TXB2，较低水平的PGE2，表明TAM-EVs增强了癌症细胞COX1/TBXAS1并抑制COX2/ PGES依赖的通路。TAM-EV可改变癌细胞产生的PG和TX。

 图4. TAM-EVs脂质组的分子和功能

综上所述，细胞外囊泡(EV)，包括外泌体，调节癌症生物学的多个方面。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)分泌EV，但它们的分子特征和功能尚不清楚。本研究报道了小鼠TAMs释放的EV (TAM-EVs)的富集、定量、蛋白质组和脂质组分析方法。

与源TAMs相比，TAM-EV与具有Th1/M1极化有关的分子特征，增强炎症增强和免疫反应，更有利的病人预后。因此，体外实验证明富集的TAM-EV促进T细胞增殖和活化。TAM-EVs还含有生物活性脂质和生物合成酶，这可能改变癌细胞的促炎信号。因此，尽管TAMs在很大程度上是免疫抑制的，但它们的EV有可能刺激而不是限制抗肿瘤免疫。

参考文献

Chiara Cianciaruso, et al., 2019, Molecular Profiling and Functional Analysis of Macrophage-Derived Tumor Extracellular Vesicles. Cell Reports.