5月6日，国际学术期刊Plant Physiology在线发表了中国科学院植物研究所种康院士研究组题为The protein modifications of O-GlcNAcylation and phosphorylation mediate vernalization response for flowering in winter wheat的研究论文。文章运用蛋白质糖基化和磷酸化修饰组学，揭示了O-GlcNAc修饰在冬小麦经春化反应及促进开花的中的作用，并分析了春化反应中O-GlcNAc和磷酸化蛋白的动态变化趋势。

乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)是丝氨酸和苏氨酸侧链上一种简单的单糖修饰，参与多种生物过程的调节。葡萄糖代谢中己糖胺生物合成途径中产生的尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc) 是O-GlcNA的直接供体。两个保守的O-乙酰氨基葡萄糖转移酶( O-GlcNAc transferase，OGT )和O-乙酰氨基葡萄糖苷酶( O-GlcNAcase，OGA)介导蛋白O-GlcNAc修饰的可逆反应。

蛋白质磷酸化是一种主要的翻译后修饰，调控多种多样细胞内各种信号转导的过程和功能。蛋白激酶催化三种氨基酸丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸磷酸化修饰，蛋白磷酸酶介导磷酸化修饰去除。蛋白质的动态磷酸化修饰在内源性激素的感知、转导和响应环境应激中起重要作用。O-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）修饰和磷酸化两个翻译后修饰通常对蛋白质功能的调节具有拮抗作用。然而，在植物中，这两种蛋白质修饰之间的相互调节和联系却鲜为人知。

温带地区冬季一年生植物秋季播种，在经历了冬天长时间的低温暴露后春季开花，这个过程被称为“春化”。在温带作物如小麦中，研究者之前克隆了春化诱导基因VER2，VER2可以特异性地与GlcNAc结合，在春化作用中引起全蛋白水平上O-GlcNAc修饰水平的增加。春化过程中，磷酸化VER2能够识别O-GlcNAc修饰的TaGRP2并抑制其细胞核中积累减弱其与TaVRN1的结合，从而释放对TaVRN1的抑制作用，最终促进开花。这些结果说明了O-GlcNAc信号在春化促进冬小麦开花中的作用。

研究精读

在本研究中，作者利用蛋白质糖基化和磷酸化修饰组学和分子生物学策略，揭示了O-GlcNAc修饰和磷酸化修饰动态调控春化作用介导小麦开花的机制。

1. O-GlcNAc信号通过调控VRNs来加速春化作用促进的开花

为了探讨O-GlcNAc信号转导的生理功能，作者利用OGA的抑制剂处理V0(非春化作用)， V14 (春化作用14天）及V21 (春化作用21天）的冬小麦品种京东1号(JD1)。与对照组相比，PUGNAc处理V14和V21的冬小麦开花更早，但在未发生春化的小麦(V0)中未见这种效应(图1A-C)。PUGNAc处理后的V7、V14和V21小麦与未处理组相比，两种促花基因TaVRN1和TaFT的表达的增加，抑制开花的TaVRN2表达降低(图1D)。因此，O-GlcNAc信号可能通过调控春化反应基因如TaVRN1、TaVRN2、TaFT来调控小麦春化影响开花。

图1. O-GlcNAc信号转导加速了春化促进了冬小麦开花转变

2. 蛋白质O-GlcNAc和磷酸化修饰在春化过程中的全谱研究

为了了解参与春化过程中O-GlcNAc和磷酸化蛋白的全谱变化，研究者使用了蛋白质组学方法来富集和鉴定这些蛋白质。对未春化(V0)、春化2天(V2)、春化21天(V21)以及春化21天、35℃下暴露5天去春化(V21+5，简称V21*)的小麦胚珠进行比较(图2A)。采用LWAC(凝集素弱亲和层析)和LC-MS/MS方法对O-GlcNAc修饰的肽段进行富集鉴定(图2B)。在未春化小麦胚珠和春化小麦胚珠中只有34个差异蛋白(图2D)。蛋白提取并经胰蛋白酶消化后，用对不同样品进行iTRAQ标记定量，然后用TiO2柱富集磷酸化肽段，LC-MS/MS分析磷酸化蛋白(图2C)。最后得到参与春化反应的205个特异性肽段对应124个磷酸化蛋白（SCPL）(图2 E)。这表明O-GlcNA和磷酸化修饰在春化过程中动态地调控许多蛋白质。

图2. 春化不同时间O-GlcNAc或磷酸化修饰肽段富集及蛋白鉴定

3. GlcNAc修饰蛋白和SCPL蛋白的功能分类

为了探索已鉴定的O-GlcNAc修饰和SCPL蛋白的功能，GO分析发现非春化小麦胚珠或春化小麦胚珠中已鉴定的O-GlcNA修饰蛋白参与一系列生物学过程，如对非生物刺激的反应、对激素的反应、基因表达、核苷代谢过程和发育过程(图3A)。GO富集分析表明，非春化小麦中，O-GlcNAc修饰蛋白质主要参与茎系统发育，植物器官发育和脱落酸反应(图3B),而春化特异性 (V21) O-GlcNAc修饰蛋白质功能主要为细胞分裂素反应,信号转导,生殖过程(图3C)。V0-和V21特异性O-GlcNAc修饰蛋白中富集条目明显不同。这表明，O-GlcNAc修饰蛋白可能通过激素信号传到、茎和生殖发育以及基因表达等综合过程介导春化。

进一步分析表明，这些响应春化反应的O-GlcNAc或磷酸化蛋白属于如下四个簇(图3D):第一类是激素反应，包括多种激素反应因子。第二组为应激反应。第三个集群是参与能源和碳水化合物代谢。第四个簇富含遗传信息处理因子。

图3. 鉴定的O-GlcNAc修饰蛋白的生物富集过程

4. TaGRP2上O-GlcNAc和磷酸化修饰位点的突变可能影响其与TaVRN1-RIP3的结合

质谱鉴定到31个同时具有O-GlcNAc和磷酸化的蛋白，作者选择了RNA结合蛋白TaGRP2进行进一步研究，以验证经翻译后修饰在春化过程中发挥重要作用。

从MS数据中可以看出，TaGRP2的Ser87为O-GlcNAc修饰位点，而Ser152为磷酸化位点(图4A-C)。为了检测O-GlcNAcylated和磷酸化位点对TaGRP2功能的影响，采用RNA-EMSA实验分析了TaGRP2和TaGRP2突变体与TaVRN1-RIP3的结合。RNA-EMSA结果显示，TaGRP2的O-GlcNAc修饰位点(T17和S87)或磷酸化修饰位点(S152)的突变改变了TaGRP2-TaVRN1-RIP3复合体条带的信号强度(图4D)。这三个修饰位点可能对TaGRP2结合RNA的功能起重要作用。

图4. S87或S152突变体影响了TaGRP2与TaVRN1-RIP3的结合

综上所述，作者研究了O-GlcNAc修饰在春化过程中的动态变化，探讨了的O-GlcNAc修饰信号在调节春化反应中的重要性。此外，作者还鉴定了春化过程中数百种具有O-GlcNAc修饰或磷酸化动态修饰的蛋白，这些蛋白质主要参与代谢过程，细胞过程和对刺激的反应。最终数据表明，O-GlcNAc修饰和蛋白磷酸化修饰可能在春化反应中发挥作用，调节小麦开花VRNs的转录网络。

参考文献

Shujuan Xu, et al., 2019, O-GlcNAcylation and phosphorylation mediate vernalization response for flowering in winter wheat. Plant Physiology.

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