评述：孙泽宇（浙江大学附属第一医院）

编者按：近年来，高通量蛋白组学技术已被广泛地应用于临床疾病标志物的批量开发。然而由组学产生的大量候选标志物具有较高的假阳性率，后期临床转化极具挑战性。为此，新兴的靶向组学技术（PRM）开始成为批量验证标志物的首选手段。今天为大家带来近日发表在Theranostics上的文章，浙大一附院李兰娟院士团队基于血液蛋白质组学开发慢加急性肝衰竭（ACLF）精准诊断蛋白标志物组合。我们有幸邀请到本文的一作孙泽宇老师对文章进行评述，分享开展研究的思路和期间发生的科研故事，精彩不容错过。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是全球性的公共卫生问题，统计结果显示全球有超过2.5亿的人群感染，并且引发了近900万人的死亡，其中中国是乙肝病毒高发地区。在庞大的慢性乙肝（CHB）人群中，部分患者可以出现严重的肝炎急性发作，发展成重症肝炎，即慢加急性肝衰竭（ACLF）。

慢加急性肝衰竭进展迅速，通常会在几周内出现高黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病等并发症，平均病死率40%左右。因此，开发有效的ACLF早期预警与预后判断标准是肝病重症化研究的重点和难点，对指导ACLF个性化治疗、合理分配人工肝和肝移植资源、降低死亡率有重要的临床意义。

肝脏是血液蛋白的主要来源，肝脏特异性的像白蛋白 (HSA、AFP、Gc)、脂蛋白 (Apo) 、一些凝血因子、补体成分等在血液中具有很高的峰度，目前已有很多研究利用血液中的蛋白来研究肝脏疾病的发生发展。因此针对血液蛋白组的研究能够帮助鉴定ACLF的进程并指导治疗。

近日，浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室李兰娟院士团队在生物医学一区杂志Theranostics上报道了一项利用蛋白质组学筛选、靶向蛋白组学（PRM）验证的思路开发ACLF临床治疗中诊断及预后血浆蛋白标志物组合的研究。研究者通过蛋白质组学技术筛选验证的4个蛋白（APOC3+HRG+TF+KLKB1）组成的P4评分以及4个蛋白（GC+HRG+HPR+SERPINA6）与4个临床指标（INR+Age+NEU+TotalProtein）组成的P8评分为ACLF的精准诊断和预后提供可能。

该研究为未来临床上实现HBV-ACLF预警及预后、指导临床诊治、降低ACLF相关病死率提供了指导，展示了蛋白质组学技术在临床研究中广阔的应用前景。浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室、浙江大学感染性疾病诊治协同创新中心李兰娟院士为文章的通讯作者，课题组成员孙泽宇助理研究员、刘小丽主任医师及吴大先博士生为文章共同第一作者。

研究速读

研究思路：研究者首先选取了16例慢性乙肝病人（CHB），19例乙肝病毒引发的慢加急性肝衰竭患者（HBV-ACLF），10例正常人对照，进行高通量蛋白质组学研究去揭示ACLF相关的血浆蛋白质组的变化。

接下来作者通过统计学与生物信息学方法挑选了28个与ACLF临床表型相关且肝特异性较好的候选标志物并在77个健康人对照、92个CHB病人、71个HBV-ACLF患者群体中运用靶向蛋白质组学进行验证。随后将筛选鉴定的潜在标志物与临床指标进行联合分析进而鉴定ACLF临床诊断和预后的蛋白质标志物组合指标。

 图1. 利用蛋白质组学鉴定和开发ACLF相关蛋白标志物的研究思路

1. 高通量蛋白质组学揭示CHB到ACLF的血浆蛋白组变化谱

研究人员通过一套基于CPLL低丰度蛋白富集-高pH反相色谱-低pH反相色谱-质谱联用的蛋白组学手段，检测了血浆中约1300多种蛋白，并结合二甲基化同位素化学标记定量法，详细描绘了从健康到CHB到ACLF发病过程中血浆全蛋白组的变化谱。研究者发现脂类代谢与运输、凝血与补体系统、固有免疫及炎症调控因子的缺失与ACLF的众多临床表象及并发症密切相关并推测ACLF发病过程中肝脏蛋白合成能力受限是导致血液蛋白组变化及相关并发症出现的重要原因。

图2. 高通量蛋白质组学揭示CHB到ACLF的血浆蛋白组变化谱

2. 靶向蛋白质组学验证筛选的潜在生物标志物

在大规模血浆蛋白组研究的基础上，研究者通过统计学与生物信息学方法挑选了28种与ACLF临床表型相关且肝特异性较好的候选标志物，并利用靶向蛋白质组学（PRM）技术在77例正常人，92例CHB病人，以及根据最新发布的中国慢加急性肝衰竭诊断标准（COSSH）入组的71例ACLF患者组成的验证队列中开展了高通量候选标志物的验证工作。验证数据证实了这些蛋白在ACLF样本中的显著变化。

图3. 靶向蛋白质组学验证筛选的潜在生物标志物

4. 建立HBV-ACLF诊断和预后panel

进一步将筛选验证的蛋白结合临床指标分析，作者发现在其中4个蛋白（APOC3+HRG+TF+KLKB1）组成的P4评分可明显区分CHB和ACLF病人（AUC=0.956），而利用HP+KLKB1的双蛋白组合则能够提示CHB的恶化（ACU=0.842），为ACLF的早期预警提供可能。其中4个蛋白（GC+HRG+HPR+SERPINA6）与4个临床指标（INR+Age+NEU+TotalProtein）组成的P8评分可以明显预测28天（AUC=0.882）和90天（AUC=0.871）内的死亡事件，且其预测能力高于现有临床上常用的MELD，CLIF-CACLF以及COSSH评分。值得一提的是，肝外多器官衰竭（extra-MOF）是导致ACLF病人死亡的重要诱因，而P8评分可以直接预测ACLF病人短期发生extra-MOF的数量，并能直接准确预测凝血衰竭（AUC=0.815）和脑衰竭（AUC=0.842）事件的发生。

图4. HBV-ACLF诊断和预后panel的建立

小结：本文利用系统性的蛋白组学研究，通过“筛选-验证”的思路，挖掘了大量HBV-ACLF相关候选标志物，其中4个蛋白（APOC3+HRG+TF+KLKB1）组成的P4评分以及4个蛋白（GC+HRG+HPR+SERPINA6）与4个临床指标（INR+Age+NEU+TotalProtein）组成的P8评分为未来临床上实现HBV-ACLF预警及预后、指导临床诊治、降低ACLF相关病死率提供了指导。

近年来，高通量蛋白组学技术已被广泛地应用于临床疾病标志物的批量开发。然而由组学产生的大量候选标志物具有较高的假阳性率，后期临床转化极具挑战性。为此，新兴的靶向组学技术（PRM）（蛋白定量的革命性方法：靶向蛋白质组技术/PRM）开始成为批量验证标志物的首选手段。本篇研究为利用蛋白质组学技术进行临床疾病的研究提供了新思路，并展示了蛋白质组学技术在临床研究中广阔的应用前景。

孙泽宇 （浙江大学传染病诊治国家重点实验室蛋白质组学平台负责人，浙江加州国际纳米技术研究院特聘副研究员）

1、首先，能简单介绍下您的课题组和参与这项研究的研究团队？

课题组所在的浙江大学医学院附属第一医院是全国最大的传染病及肝胆疾病诊治与研究中心之一。其传染病科在目前国内同类学科中常年排名第一。传染病诊治国家重点实验室李兰娟院士团队在重型肝炎肝衰竭诊治方面具有国际领先地位，创建了人工肝系统等多项具有核心竞争力的临床诊治技术，治疗重型肝炎取得重大突破，先后荣获国家科技进步奖2项和省科技进步一等奖7项。

2、您这项研究运用蛋白质组学技术研究慢加急性肝衰竭，能给我们介绍这项研究的意义吗？

慢加急性肝衰竭（ACLF）进展迅速，通常会在几周内出现多种严重并发症和多器官衰竭，晚期治疗难度高导致病死率极高。因此，开发有效的ACLF早期预警与预后判断标准是肝病重症化研究的重点和难点，对指导ACLF个性化治疗、合理分配人工肝和肝移植资源、降低死亡率有重要的临床意义。

3、我注意到您这篇研究中采用了蛋白组，结合新兴的靶向蛋白质组学技术PRM来筛选蛋白标志物组合，能分享下您开展本研究的思路和看法吗？

对于类似ACLF这样危及生命的急性疾病，显然可以通过组学技术发现大量变化的蛋白，但是其验证工作极具挑战性：一方面，只选择其中个别标志物进行ELISA验证是对前期大量宝贵的组学数据的极大浪费，且容易遇到假阳性而导致项目无疾而终，而大量的候选标志物如果直接利用ELISA进行确证，工作量和费用是难以承受的；同时另一方面，CHB和ACLF病人背景复杂，且入组病人所在病程相差很大，导致验证工作必须纳入足够人数。想要同时在大样本中实现多因子的验证工作，我们认为靶向蛋白质组学技术PRM是能平衡两种需求的最好的选择。

4.   关于蛋白标志物如何在临床诊断和预后中发挥作用，您有什么看法或下一步的研究计划？

蛋白（或任何）标志物在临床中诊断与预后中真正想发挥作用，我认为要做到3点：1，有明确的临床问题，这个问题不但需要有临床价值，而且是要现在的手段不能轻易解决的。从我们的经历来看，组学研究的临床出发点极其重要。2，标志物不能只停留在组学数据，必须到大样本队列中进行验证，尤其是前瞻性队列中的验证。验证工作不仅是考验标志物的可靠性，更可以了解该标志物在背景复杂的病人队列中，以及在不同病程中的变化，这对其临床应用十分重要。这篇Theranostics文章只是我们ACLF蛋白标志物开发的第一步，我们手中已经有部分标志物完成了多组前瞻性队列的验证工作，相关结果正在投稿中。3，一个好的疾病标志物必然与疾病的发生发展机理有深刻联系，除了组学数据与临床验证，上游的机制研究也是说服同行们采用该标志物的重要依据。

5.   我们都知道科研不会是一帆风顺，您在这项研究过程中有遇到什么难点或者有趣的故事？能给我们分享一下吗？

是的，这项研究历经坎坷。事实上这个项目开始的时候，我们自己的蛋白组学质谱仪还没有到位，专门在浙江大学农生环测试中心的高其康教授的支持下完成了初步的数据采集。在购买了自己的质谱后，PRM数据的采集也并非一帆风顺，为保证数据质量，我们丢弃了大量不符合质量要求的数据，质谱PRM实验前后历时将近半年左右。考虑到ACLF疾病的特殊性，研究期间遇到的临床样本收集，信息收集等方面的困难是不言而喻的。这里特别感谢李兰娟院士与其临床团队对项目的鼎力支持。

这项研究的最大的困难来自于投稿期间与审稿人关于ACLF分组的争论。在ACLF诊治领域，欧美长期占有话语权，西方最早在以酒精肝为基础的肝硬化人群中发现ACLF这一终末期肝病综合征，因此视肝硬化为ACLF的一个必要前提。而西方的ACLF定义并不完全适用于亚洲在大量的非肝硬化CHB（慢性乙肝）病人群中发现ACLF。为此，李兰娟院士领导的团队在2018年发布我国的重症乙肝ACLF定义，认为中国的大量CHB病人无需经历肝硬化即可发展出ACLF。因此，现阶段东西方的临床肝病专家们对ACLF定义依然没有达成共识。而我们坚持以中国标准来定义ACLF也使得项研究最终与肝病领域内的顶级期刊失之交臂。值得庆幸的是，越来越多的文章（包括我们的研究在内）开始支持肝硬化并非ACLF发生发展的必要前提这一观点。并且，虽然病因基础不同，考虑到疾病进展的相似性，我们预测本研究中开发出的肝特异性ACLF标志物是有可能在欧美ACLF病人中被验证出来的。

参考文献：

[1]. Dienstag JL, et al., (2008) Hepatitis B virus infection. N Engl J Med.

[2]. MacLachlan JH, et al., (2015) Estimating the global prevalence of hepatitis B. Lancet.

[3]. Zeyu Sun., et al., （2019）Circulating proteomic panels for diagnosis and risk stratification of acute-on-chronic liver failure in patients with viral hepatitis B. Theranostics.