编者按：每年2月的最后一天，是国际罕见病日。在全球，每1万人中就有6-10个罕见病患者。较为人熟知的罕见病包括苯丙酮尿症、地中海贫血、成骨不全症(俗称玻璃娃娃)等，但仍有很多罕见病不为人知。国际确认的罕见病有6000-7000种，约占人类疾病的10%。半数患者在出生时或者儿童期已经发病，但遗憾的是只有5%的罕见病有获得批准的治疗方法。

我国在罕见病防治管理方面也做了大量工作。2018年5月，国家联合印发了第一批罕见病目录，共收录了121种罕见病。2019年2月27日，国家卫生健康委办公厅正式发布了《罕见病诊疗指南（2019年版）》，对121种罕见病从病种概述、病因和流行病学、临床表现、辅助检查、诊断、鉴别诊断、治疗等方面进行了详细规范和指导。

面肩肱型肌营养不良(FSDH)为罕见病进行性肌营养不良（progressive muscular dystrophy，PMD）的一种，是一种异质性肌肉退化的常染色体显性遗传疾病，病变主要侵犯面肌、肩胛带及上臂肌群。全球约有80万的FSHD患者，寻找FSHD的分子和遗传原因有助于阐明病理生理学的机制。

 FSDH病变主要侵犯面肌、肩胛带及上臂肌群

2019年1月15号，美国西雅图弗雷德哈钦森癌症研究中心的Robert K. Bradley等人在eLife杂志发表题为“Quantitative proteomics reveals key roles for post-transcriptional gene regulation in the molecular pathology of facioscapulohumeral muscular dystrophy”的研究论文。运用定量蛋白质组学等技术，为FSDH生物标志物临床相关性研究提供相关证据，更深入揭示了FSDH转录后调控的分子病理。

研究背景

FSHD由Dux4逆转录基因嵌入4号染色体D4Z4重复单元造成的一种低效率重复介导的表观遗传抑制性疾病，DUX4是一种转录因子，其在骨骼肌中的异常表达导致FSDH。目前，大多数关于DUX4活性研究都集中在转录层面的基因表达检测，但众所周知，RNA和蛋白质水平并不总是一致的，转录后的调控可能导致RNA和蛋白质水平差异。

本文中作者利用先前建立和验证的DUX4表达细胞培养模型开展RNA-Seq以及SILAC标记的定量蛋白质组学研究，对约4,000个基因的转录组和蛋白质水平的改变进行准确的定量。通过比较转录水平和蛋白质水平的改变，研究者将基因子集分成三种不同的表达模式：1）RNA和蛋白质水平上的表达变化一致的DUX4靶基因；2）发生转录后基因表达缓冲的基因，特别是那些参与压力反应途径的基因；3) RNA与蛋白质水平上的表达变化不一致的基因，特别是那些参与RNA监测的基因。从而揭示了FSHD存在的广泛的转录后调控机制。

研究速读

1. 定量质谱法检测DUX4表达细胞的蛋白水平变化

研究者首先构建了DUX4表达肌肉细胞培养模型（样本）作为研究对象，分别为利用慢病毒载体介导的基因表达（vDUX4）以及转基因技术将DUX4整合到基因组后诱导表达（iDUX4）。随后通过SILAC标记的定量蛋白质组学方法（质谱策略）检测了中DUX4表达前后细胞差异蛋白（图1）。

 图1 DUX4表达细胞的定量质谱分析

2. RNA和蛋白质表达的一致性评估

利用iDUX4数据集，研究者最终获得了4005个基因的定量蛋白质组学信息，其中3961种基因也有相应的RNA-Seq定量。为了进一步对一致性基因进行定量，作者对3961个基因的RNA与蛋白质变化倍数做了散点图（图2B）,发现他们之间相关系数r为0.51（p值<2.2e-16）。转录水平的变化主要发生在参与转录和mRNA加工处理的基因中，而蛋白质水平的变化则影响包括体液免疫反应、蛋白水解以及细胞外分泌等途径（图2C）。Golgi成像发现DUX4表达细胞出现高尔基体严重碎片化，这表明细胞分泌途径可能受到了干扰（图2D-E）。这些结果表明，蛋白质水平的分析可能给我们带来早期转录组研究中无法认识到的观点。

 图2 DUX4调控靶基因RNA和蛋白质丰度一致性变化

3. 应激反应基因存在广泛的转录后缓冲表达

研究发现，尽管一部分基因在转录水平出现很大程度的上调或下调，但其蛋白质水平却没有变化，暗示着DUX4调控靶基因存在转录后蛋白质水平上的表达缓冲（图3A），其中包括对蛋白质折叠应激或dsRNA诱导应激反应的管家基因（图3B）。这些数据表明，由细胞应激和转录后缓冲引起的翻译抑制阻止了表达DUX4的细胞产生应激反应。

图3. DUX4表达细胞中应激反应基因广泛的转录后缓冲表达

4. DUX4对RNA质量控制通路的调控机制

最后，研究者将分析的重点放在转录后调控途径，即蛋白质水平上出现显著变化，而转录水平上没有变化，或变化趋势相反的基因子集上（图4A，198个基因）。通过对转录后调控途径无义介导的RNA降解（NMD）途径以及泛素-蛋白酶体成分及调节因子的mRNA及蛋白水平表达变化进行分析，研究发现转录后基因调控在NMD抑制和DUX4表达细胞中的蛋白沉积的分子机制，这也可能是FSHD病理学的关键方面（图4D）。

 图4. DUX4诱导的转录后基因调控

总结

本研究在两种不同的FSHD细胞培养模型中使用RNA-Seq以及定量质谱法技术检测了基因RNA以及蛋白水平，发现很多受DUX4转录调控的基因都有效的进行了翻译，暗示了FSDH生物标志物临床相关性研究的可能性。

DUX4表达后导致大量的mRNA和蛋白质的表达水平出现不一致的现象，说明仅仅从转录层面分析DUX4的生物学作用是不完善的。最后通过分析RNA与蛋白质水平上的差异表达，揭示了转录后基因调控在NMD抑制和DUX4表达细胞中的蛋白沉积的分子机制。

罕见病中80%以上属于遗传疾病，目前，大多数针对罕见病的研究集中在基因与转录层面的表达检测。蛋白质是生命活动的承担者，也是直接导致疾病发生的生物大分子。蛋白质水平的分析可能给我们带来基因组与转录组研究中无法认识到的观点，从而更深入的揭示疾病的分子病理，实现精准诊断、精准治疗的目的。

参考文献：

Jagannathan S., et al. (2019) Quantitative proteomics reveals key roles for post-transcriptional gene regulation in the molecular pathology of FSHD. eLife.