景杰编者按：众所周知，2013年诺贝尔生理学或医学奖被授予了发现囊泡转运机制的詹姆斯·罗斯曼、兰迪·谢克曼和托马斯·聚德霍夫3位科学家。近日(2019年1月2日），德国海德堡大学（建立于1386年，是德国最古老的大学）生物化学中心的研究人员们在学术期刊Cell Reports上发表了最新研究成果，Adolf等科学家利用体外重组实验并结合基于SILAC的质谱分析技术来揭示这些运输囊泡的核心蛋白质组，并明确了衣被蛋白亚型的作用。

值得一提的是，此文是一篇值得借鉴的经典案例，研究者以前人重要研究理论为依据，充分借助最新的蛋白质组学技术从而更进一步发掘并阐明了囊泡运输的机制，最终研究成果再一次发表在高水平学术期刊上。

囊泡转运过程的第一步是膜通过出芽方式形成一个囊泡。囊泡的外表面被蛋白包被。通过改变膜结构的构象，这些蛋白将促使囊泡形成。这些囊泡被分成披网格蛋白小泡、COPI被膜小泡以及COPII被膜小泡三种类型。其中：披网格蛋白小泡穿梭于外侧高尔基体和细胞质膜之间，COPI被膜小泡则主要介导蛋白质从高尔基体运回内质网，COPII被膜小泡则介导非选择性运输（图1）。

三类囊泡运输通路的示意图，箭头指示囊泡运输方向

三种囊泡介导不同途径的运输，分工井井有条。并且为了让囊泡朝着正确的方向前进，细胞会布置坚固的微丝和微管为囊泡构筑“快速运输通道”。在这些细胞骨架之上，一些特别的分子马达，如动力蛋白和驱动蛋白会背负着囊泡的一步一步向目的地迈进。

分子马达与装载特定货物的囊泡之间是严格配对的，一些类型的囊泡甚至可以配备“飞行器”级别的运输动力。 蛋白从ER运输到Golgi通过COPII有被小泡完成，它由5个细胞质蛋白组成（分别是Sar1、内衣被组分SEC23和SEC24,外衣被组分SEC13和SEC31）。SEC24在真核生物中高度保守,其表面分布多个货物结合位点,能和分泌蛋白的信号肽相互作用,进而将蛋白招募到COPII小泡中。

研究者以前人重要研究理论为依据，充分借助最新的蛋白质组学技术从而更进一步发掘并阐明了囊泡运输的机制。

在研究思路上，研究者首先完成了基于SILAC的同位素COPII囊泡的蛋白质组学分析，接着鉴定到Sec24-异构体特异性COPII蛋白并阐述了Sec24D突变体在成骨不全发育中的生化特性， 随后作者还分析了COPI囊泡的核心蛋白质组， 最后用蛋白质组学分析了用各种Arf亚型重构的COPI囊泡和从各种细胞类型重组的COPI囊泡。

1.从Semi-intact细胞体外重建COPII和COPI囊泡

Semi-intact细胞是指细胞膜通过被毒素渗透而形成孔洞的细胞。作者首先优化了COPII和COPI小泡重建和纯化的实验方法，并描绘了用于定量质谱分析的Semi-intact细胞体外囊泡重建实验(SICs)示意图（图1上）。接着用透射电镜对包囊组分进行了分析，确认了在用GMP-PNP重建的COPII和COPI小泡的超薄切片中，是以直径在60 ~ 100 nm的包膜小泡结构为主（图1下）。

 图1 从Semi-intact细胞体外重建COPII和COPI囊泡

2. 基于SILAC的定量质谱分析COP小泡

 研究者选择基于SILAC的COP囊泡定量蛋白质组学分析，工作流程如图2 所示：（1）细胞在含有“轻“的天然氨基酸（Lys-0 / Arg-0）或 “重”的有C13 / N15标记的氨基酸（Lys-8 / Arg-10）的培养基中培养。（2）从轻和重细胞制备SIC用于体外重建COP囊泡。（3）如图所述分离囊泡。 （4）将相应的囊泡样品混合并通过质谱法分析。

图2 SILAC定量质谱分析

值得一提的是，为了排除代谢标记可能对货物蛋白质摄取产生的任何影响，文章中所有测定都作为标记转换实验进行。

3. 鉴定HeLa细胞COPII囊泡的核心成分

接下来，研究者运用定量质谱分析揭示了哺乳动物COPII囊泡核心蛋白质组（图3C-3H）。 选择log2 SILAC比率> 1的蛋白质被认为是COPII相关蛋白质，分别用Sec23A / 24A（图3C和3F），Sec23A / 24C（图3D和3G）或Sec23A / 24D（图3E和3H）重建鉴定到50, 78和72个COPII蛋白。 许多这些蛋白质在早期分泌途径中起作用（以红色突出显示并在图3C-3E中用其基因名称标记）。用 富含Sec24A，Sec24C和Sec24D重建的COPII囊泡的前30种蛋白质按其平均log2 SILAC比例排列，如图3F-3H所示。

图3鉴定HeLa细胞COPII囊泡的核心成分

4. 鉴定发现Sec24D突变体在成骨不全发育中的生化特性

作者为了对COPII囊泡中的旁系同源特异性包装的深入定量观察，在SILAC实验中直接比较了Sec24A和Sec24C囊泡（图4 上）。研究观察到两类蛋白质。第一类显示没有特定Sec24 paralog的偏好。其中有ERGIC53 / LMAN1。第二类由COPII的client组成，这些client特别富含由特定Sec24旁系同源物产生的囊泡。通常，在包装COPII客户时，Sec24A囊泡的效率低于Sec24C COPII囊泡。

图4 鉴定Sec24-异构体特异性COPII蛋白

为了研究Sec23A / 24D S1016F的SNARE相互作用受损的功能意义，通过蛋白质印迹比较用变体或野生型外壳蛋白产生的COPII囊泡（图5）。 在所有囊泡样品中发现了类似量的通用COPII客户端ERGIC53。 相反，与pull-down结果一致，通过点突变S1016F很大程度上削弱了Syntaxin5向COPII囊泡的分选。 这种SNARE包装缺陷不仅影响Syntaxin5，还影响其他两个Q-SNARE Bet1和GS27。

图5 Sec24D突变体在成骨不全发育中的生化特性

5. COPI囊泡的核心蛋白质组

 同样，平均log2 SILAC比率> 1的蛋白质被认为是COPI相关蛋白质（图5B）。组合中的114个候选物构成了HeLa细胞的COPI囊泡核心蛋白质组，其中前40个命中物被描绘于图5C中。同种型COPI囊泡的比较哺乳动物细胞表达两个外壳体亚基γ-COP和ζ-COP的旁系同源物，命名为γ/1 / 2-COP和ζ1 / 2-COP。

 为了研究这些同种型在货物选择中的可能作用，作者通过定量蛋白质组学直接比较了用不同的外壳异构体（CMγ1ζ1与CMγ1ζ2和CMγ1ζ1与CMγ2ζ1）制备的COPI囊泡的蛋白质含量。 与使用Sec24旁系同源物进行的类似实验相反，未发现通过含有γ/ζ-COP同种型的不同组合的七聚体外壳复合外壳蛋白优先分选单个蛋白质（图5D和5E）。

 图6 COPI囊泡的核心蛋白质组

6.蛋白质组学分析HepG2、HELA和小鼠巨噬细胞中COPI

之前的实验已经在HeLa细胞中定义了COPII和COPI囊泡核心蛋白质组，作者希望探寻囊泡蛋白质组成在不同来源的细胞系之间的差异。为此，他们分析了用肝细胞样HepG2细胞和永生化鼠巨噬细胞（iMF）中CMgγ1ζ1产生的COPI囊泡的蛋白质组。

他们定义了67种HepG2细胞的COPI蛋白质组和144种蛋白质的iMF，并在HeLa细胞中进一步鉴定。所有蛋白质的直接比较揭示了在所有三种细胞类型的COPI蛋白质组数据集内共有38种蛋白质，并且在至少两种细胞系中发现了207种鉴定的COPI相关蛋白质中的40％。

共享的38种蛋白质占不同的官能团。除了诸如SNARE和系链的融合机制之外，还明显富集早期循环蛋白（例如，p24 / TMED家族蛋白，LMAN1 / ERGIC53，Rer1）。共有蛋白质是非蛋白质。四个非跨膜蛋白家族成员中的两个（TM9SF1和TM9SF3）是HeLa，HepG2和iMF细胞的COPI蛋白质组的保守组分（图6 右）。HeLa COPI蛋白质组大部分吞噬了HepG2细胞。相比之下，分别来源于HeLa和iMF细胞的COPI囊泡中鉴定的蛋白质的约35％和55％是非重叠的。

然而，这些蛋白质中的大多数属于三种蛋白质组共有的功能类别，特别是许多糖基化酶。在巨噬细胞中观察到的一般糖基化模式与亲本单核细胞强烈不同，后者转化为糖基化酶的独特表达谱。因此，这并不是来自不同细胞系的COPI囊泡的组成的主要变化，反映各种细胞系的分子身份的不同表达水平可能解释了观察到的部分非重叠的蛋白质组。

图7 HepG2、HELA和小鼠巨噬细胞中COPI

真核细胞内膜系统的胞内运输和稳态依赖于囊泡载体的形成和融合。外壳蛋白复合物(COPII)小泡从内质网(ER)输出新合成的分泌蛋白，而COPI小泡促进了从高尔基体到ER和高尔基内的运输。哺乳动物细胞表达COPII和COPI外壳蛋白的各种亚型。

为了研究外壳蛋白旁系同源物的作用，作者将来自半完整细胞的体外囊泡重建与基于SILAC的质谱分析相结合。 在这里，作者描述了哺乳动物COPII和COPI囊泡的核心蛋白质组。 虽然用cargo结合亚基Sec24的各种同种型重构的COPII囊泡的组合物是根据所用的旁系同源物而不同，但COPI包衣的所有同种型产生了具有惊人相似蛋白质组成的COPI包被的囊泡。所有的COPI包被层的亚型产生的COPI包被层囊泡具有惊人的相似的蛋白质组成。

总之，本文亮点：

1.基于SILAC的蛋白质组学揭示了哺乳动物COPI和COPII囊泡的蛋白质组 

2. ERGIC1，一种假定的cycling cargo adaptor，是一种Sec24C / D依赖的货物蛋白 

3. CNIH4是一个控制GPCR退出内质网的adaptor，是一个依赖于Sec24A的client.

 4.用不同γ/ζ-COP和Arf旁系同源物产生的COPI囊泡具有相似的蛋白质组

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参考文献：

Hsu, V. W., et al., (2009). The evolving understanding of COPI vesicle formation. Nature reviews Molecular cell biology.

Dunlop, M.H., et al., (2017). Land-locked mammalian Golgi reveals cargo transport between stable cisternae. Nat. Commun.

Adolf, F., et al., (2016). Sec24C/Disoform- specific sorting of the preassembled ER-Golgi Q-SNARE complex. Mol. Biol. Cell.

Adolf, F., et al., (2019). Proteomic Profiling of Mammalian COPII Vesicles，Cell Reports.