本周第一篇精读文献为浙江工商大学的《 HpaI在毕赤酵母GS115中的表达及肝素酶I产生条件的优化》。

对于蛋白的异源表达，最常见的是将其导入原核细胞中，比如DE3中进行表达优化，而该文章首次选用真核生物 Pichia酵母（GS115）进行表达。主要方法为通过PCR的方法将HepI（HpaI）片段从肝素黄杆菌中获得，并连入质粒pPIC19K中制的重组质粒pPIC9K-HpaI，通过CaCl2的方法转化入DH5α中。用Bpu1102I将质粒pPIC9K-HpaI线性化，通过同源重组整合到GS115的基因组中，使其能够随着基因组的表达而稳定存在并表达，采用化学转化与电穿孔组合的方法将线性化质粒导入GS115中，并在不同浓度的G18抗性的YPD平板上30℃培养，以筛选出最佳的单菌落。再通过Plackett–Burman 设计和Box–Behnken设计挑选出表达肝素酶I的最佳反应条件。

Plackett-Burman试验就是筛选试验设计，主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著影响，采用的试验设计方法。它主要通过对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。

培养基优化，是指面对特定的微生物，通过实验手段配比和筛选找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。

第二篇文献是《水中肝素触发剂量依赖性多色发射转换：现实生物流体中肝素酶I估算的便捷方案》。基于低聚（对苯乙烯）的双吡啶衍生物对水中肝素的“比值”检测。我们首次提出在肝素存在下呈现剂量依赖性多色发射转换。用肝素作为刺激物的探针的可逆自组装也用于筛选肝素酶I。

传统的肝素测定方法是间接的，其主要依赖于监测活化的凝血时间（ACT），抗Xa和活化的部分促凝血酶原激酶时间（aPTT）。然而，由于其他生物因素的潜在干扰，这些方法昂贵且不太具体。后来，人们考虑利用小有机分子进行肝素的特异性检测或定量。但是，由于大多数探针在单点波长下发生光信号的变化，因此通常会发现受外界因素例如，仪器校准，光强度的变化等的影响。因此我们尝试使用比值型荧光传感器，因为它们可以通过考虑两个光谱带（来自未反应/单体和反应/聚集的探针）的发射变化，有效地消除大部分或全部环境干扰。

本文首次报道了剂量依赖性，肝素诱导的比率发射转换，通过控制共轭双吡啶亚苯基亚乙烯基（PPV）荧光探针在水中形成异构体的程度。肝素引发的可逆聚集现象被进一步用于开发肝素酶I测定的新技术。原理如下图：

我们引入了共轭双吡啶基苯乙烯分子探针，因为它们独特的肝素触发剂量依赖性，在水中生理pH下的多色发射开关。进一步利用肝素诱导的可逆聚集体形成，建立了生物流体中肝素酶I的简易操作测定方法。在低成本彩色条带上观察到剂量依赖性的发射调制，从而保证了未知样品中肝素的快速现场检测。

该文献可能会对我实验后期测定剩余肝素的含量的方法有一些参考意义。