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【方法篇】研究RNA互作结合蛋白(RBPs)的方法

已有 1070 次阅读 2019-5-14 14:29 |个人分类:蛋白质组学|系统分类:论文交流| RBPs;

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由于RNA结合蛋白(RBPs)显著的生物学功能,它们的表达情况和活性状态能否提供细胞系统的诸多信息。科学家们最近开发了一种新的技术手段,可称为相互作用体捕获手段,用于识别细胞中的活性RBPs。利用紫外线交联RBPs与RNA聚合物,并通过寡聚dT磁珠共价结合蛋白质。经过清洗后,再通过质谱检测结合蛋白。此实验方法大概耗时3天,并且该方法可以用在不同生物状态下,包括代谢、细胞周期、分化、发育或者对药物的反应等。


已经有许多方法用于研究mRNA相互作用蛋白,例如采用全基因组矩阵和荧光RNA探针对酵母RBPs进行系统的鉴定。当然采用固定化的RNA探针作为诱饵,在体外捕获特定的RBPs,然后在对其进行质谱检测。

然而,这些方法不能区分活细胞中发生的RBPs和非生理状态下的RNA-蛋白结合体。

 

因此有科学家开发了相互作用体捕获技术来克服这些限制,结合紫外线交联和Oligo(dT)捕获技术来获取活细胞中RBPs。



实验方法流程


为了在体内将RBPs和RNA共价偶联,单层细胞在254nm紫外光照射下,将Phe、Trp、Tyr、Cys、Lys等氨基酸与核苷酸发生交联,同时也应用了光活化核苷酸4-硫代嘌呤增强交联效果。这种核苷酸类似物被细胞吸收并用于合成新的RNA。在365nm的紫外光处理下可诱导蛋白质与RNA发生交联。细胞裂解之后,利用寡聚(dT)磁珠捕获聚腺苷酸RNA。经过清洗之后,与polyA+RNA结合的RBPs经过RNase处理后释放,随后对其进行质谱鉴定。



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 图1

 

实验设计

 

设置对照组

设置一个对照组,区别于UV紫外线辐射组,为了区别出寡聚(dT)结合的污染物,以及磁珠非特异性结合的蛋白质。

 

UV cross-linking

0.15Jcm-2对于细胞Hela、Huh-7和HEK293在254nm(cCL)和365nm(PAR-CL)紫外线照射下最优剂量,当然如果选择其他的细胞则需要进行条件优化。

 

4SU incorporation

4SU对于Hela、Huh-7和HEK293细胞的最佳处理浓度是100μM,其他的不同细胞处理浓度也需要进行优化。细胞交汇状态下或者增值较慢的细胞需要较高浓度的4SU或者较长的孵育时间,以便将核苷酸类似物4SU充分进入RNA中。


Celllysis

对细胞进行适当的裂解是RBPs捕获过程中最关键的步骤之一,并且需要对其进行优化。裂解缓冲液处理后通常会粘度变高,但是如果粘度较高,污染物会被困在亲和珠子中,影响mRNA分离的纯度。当细胞裂解液在均质化后仍然非常致密时,我们建议增加裂解液缓冲液的体积,促使裂解液更好的进行均一化。

 

Bead recycling

为了控制试剂成本,polyA RNA的捕获过程分为三个连续的循环,并可重复使用相同的珠子。

如果使用的亲和磁珠数量不能有效地完全富集细胞的mRNA,那么可以在后续实验增加亲和磁珠数量或者分离次数。

 

Proteomics

我们在进行液质联用平台上进行蛋白质组分析,为较大程度的提高蛋白鉴定的深度,可以通过等电点聚焦技术对胰蛋白酶消化后的样本进行肽段分馏来降低样本复杂性,然后通过高分辨LC-MS/MS进行分析。其中关键的一点是分析实验组和阴性对照组中所鉴定蛋白的情况,并且此实验方法也可以适用于稳定同位素标记实验例如,SILAC和iTRAQ。


HPLC and MS parameters

应对所用液相和质谱进行优化,以最大限度地增加有效肽段鉴定的数量,通常质谱平台或者质谱服务公司都对其进行优化,不需要做特定的调整,需要注意的是,所有样本必须(包括阴性对照)都需要在相同的条件下进行分析。


Statistical data analysis

建议对样本进行设置生物学重复,样本组和对照组都是以一式三份进行分析测试,然后可以对分析的离子信息值进行t检验统计分析。

 

方法优点


此种实验方法与之前的方法有诸多优点:

  1. 在紫外光照射下,只有紧密接触的蛋白与RNA才能有效的形成交联反应。

  2. 紫外光直接作用于单层细胞,从而“冻结”了细胞内蛋白质与RNA的相互作用状态。

  3. 核苷酸杂交(polyA-olgodT)的结合是稳定的,因此能排除多聚肽段与RNA非共价结合或者蛋白与蛋白相互作用的影响。

  4. 通过此方法获取RBPs也可以用来做蛋白质组相对定量。

  5. 在不同的生物系统或者实验条件下,此捕获实验方法也可以用来研究RBPs组成和动力学研究。


方法限制


缺点主要有如下:

  1. 不能检测未结合到PolyA+RNA的蛋白质;

  2. 不能研究未在细胞中表达的蛋白;

  3. 不能检测在当前实验条件下有活性的蛋白;

  4. 未在紫外线下发生交联的蛋白,因紫外线交联效率一定,因此需要足够多的细胞下进行,例如2.8×108的细胞。


 

方法应用


RBPs的捕获可以通过小范围实验和WB检测感兴趣蛋白在体内与RNA结合情况,并通过质谱对RBPs进行分析。

该方法最初应用于Hela细胞中,现在可以应用于其他类型细胞(如干细胞),并适用于组织和单细胞或者多细胞。

另外还对此方法在其他领域应用进行了展望,作为检测RBPs对不同环境条件、刺激、治疗(如饥饿、缺氧、白细胞介素刺激、药物因素)或者发育和分化阶段的动态响应手段。


原文链接


AIMS---蛋白质谱服务商,提供快速便捷的 LC-MS/MS 蛋白定性/定量检测。



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