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把Cell爆文的思路、方法用到自己的研究中

已有 892 次阅读 2018-3-12 10:20 |个人分类:生物paper|系统分类:科普集锦

本文转载自嘉因微信公众号,已获得授权。查看最新文章,敬请关注嘉因,微信ID:rainbow-genome

 作者:小丫  来源:嘉因

今天早上刷爆朋友圈的Cell paper到底有什么重要发现?难度在哪里?《Cell丨中国学者首次报道人类早期胚胎发育染色质调控的动态图谱——附三组专家点评》(文中蓝色字都带链接)

当初Sun Yi和Xie Wei的paper都是小鼠,这次是人啊!!!对比人和小鼠,有了重要发现:“OCT4基因是人类胚胎合子期基因组激活必须的,但是在小鼠胚胎发育中则不必须。——岳峰”

小伙伴儿最关心的是:有什么思路或方法,能用到我的课题中?读原文找答案:





Graph Abstract

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  1. 2-cell,只有少量DHS;4-cell,DHS增多;8-cell,合子基因组转录激活(ZGA),出现更多的DHS;

  2. 人合子基因组激活时的DHS区域,富集了OCT4的motif;

  3. 进化上较老的基因会更早地建立DHS;

  4. DHSs在转座子区域也是逐渐增加的状态,这些转座子有物种特异性。

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思路(敲黑板!1、2条对小伙伴有很大借鉴作用)

  1. 先宏观,对比各发育阶段基因组范围DHS的数量变化。通常转录因子结合DNA,核小体结构打开;做DNase-seq实验时,这附近的DNA更容易被DNase切到,测序后就能观察到峰,定义为DHS。反推,DHS的出现预示着有转录因子结合,预示着基因转录激活;DHS数量增加预示着更多基因转录(Figure 1)

    人们已经知道8细胞期合子基因组激活,这与本文观察到的DHS数量在8细胞期大量增加相吻合。那么到底是不是这样呢?别人已经做过这一时期的RNA-seq,直接拿来用;发现启动子有DHS的基因表达量高,反之亦然。大量转录出来的基因是谁呢?都是非常非常重要的调控和发育相关基因,例如HOX家族。(Figure 2)

  2. 寻找关键转录因子。DHS预示着有转录因子结合,那么8细胞期突然增多的DHS,上面结合的是哪些转录因子呢?之前发现OCT4对斑马鱼的合子基因组激活起重要作用,人是不是这样,还不知道。于是,作者对大量涌现的DHS位点进行motif富集分析,发现8细胞期的DHS上确实富集了OCT4(Figure S5)

    这么少的细胞量,作者无法做OCT4的ChIP-seq来验证OCT确实结合在这些DHS上。如果换做其他细胞类型,审稿人会要求补ChIP实验。

    只证实OCT4结合还不够,要进一步确认结合在这里的OCT4对转录的影响。有对比才有发现。作者敲降了OCT4,做RNA-seq,跟野生型对比发现,OCT的敲降导致1/4的基因下调表达,推测这些基因的转录依赖于OCT4。再跟8细胞期启动子上有DHS的基因取交集发现,依赖于OCT4的基因当中,85%的基因在8细胞期启动子区都出现了DHS。表明这些基因启动子区出现的DHS跟合子基因组激活期的OCT4转录调控有关。小鼠的情况就不同了,不但OCT4 motif的没有富集,敲降OCT4也没有带来大量基因表达量变化(仅1.4%)。(Figure 3A,B,C)

    8细胞期的DHS上的也富集了SOX2的motif(Figure S5)。采用跟OCT4类似的方法,探讨SOX2在合子基因组激活中的转录调控作用,发现敲降SOX2后下调的基因中有161/200与敲降OCT4后下调的基因重叠;并且前面已经看到敲降OCT4后SOX2也下调表达,因此,其实SOX2就是OCT4下游的靶基因,起关键调控做用的依然是OCT4(Figure 3D,E)


    对于小伙伴儿来说,找到了关键转录因子,就可以联系基因功能,做动物实验,在体内验证调控机制。

    对于本文来讲,第一次做出人的染色质开放图谱,就要全方位彻底把规律都挖出来。因此,就有了下面的DNA甲基化、转座子和进化的研究内容。


  3. 哺乳动物胚胎中会发生DNA甲基化重编程,因此作者借助已发表的DNA甲基化数据,调查了DNA甲基化和DHS的关系。发现启动子上有DHS的比没有DHS的基因甲基化水平更低。DHS区的去甲基化水平高于非DHS区。(Figure 4)

    CpG密度与DNA甲基化水平负相关,作者发现有DHS的启动子,去甲基化水平高,CpG密度低,主要是囊胚期参与免疫应答的基因。启动子区CpG密度是否影响了DHS的建立呢?作者发现胚胎发育早期建立DHS的启动子CpG密度高于晚期建立DHS的启动子(Figure 5)

  4. DHSs在转座子区域也是逐渐增加的状态,这些转座子有物种特异性。(Figure 6)

  5. 当初Sun Yi和Xie Wei的paper都是小鼠,这次是人啊!所以一定要从进化角度好好对比一下,发现进化上较老的基因会更早地建立DHS(FIgure 7)



技术难点怎么克服?

  • 获得染色质开放数据。DNase-seq,大家都知道它好,能解决关键转录调控问题。然而技术难度超级高,世界上能做好DNase-seq的实验室寥寥无几。2013年Howard Chang发明的ATAC-seq更亲民,需要的细胞量少,50000个细胞就能做。一下子解决了这个瓶颈问题,在领域内掀起研究热潮,甚至有人开发了单细胞ATAC-seq。嘉因生物深知ATAC-seq解决转录调控问题的重要性,在国内率先开展ATAC-seq实验服务。

  • 多种数据整合分析。DNase-seq、RNA-seq、DNA甲基化测序,这么多高通量实验,要花多少银子啊?!作者只产生了DNase-seq数据,其他数据都是用前人已发表的。公共数据库里已经积累了海量的高通量测序数据,小伙伴们用力挖吧!再举个例子:《ATAC-seq能干啥?看这一篇就够了》,整合多种已发表的测序数据,深入挖掘自己的ATAC-seq。

  • 寻找关键转录因子。motif富集分析,用HOMER。嘉因小丫曾写过一系列帖子,解决motif查找问题:去哪找motif找启动子区的motif互补链上的motif有意义吗?怎样展示结果?通过motif找哪个转录因子调控我的基因。如果自己搞不定,还可以联系嘉因表观小助手:epigenomics




下面细看结果图和主要结论:


一、DHS与ZGA

人类胚胎发育过程中,DHS是逐步建立起来的你会观察到

二细胞->四细胞->八细胞->桑椹胚->囊胚,DHS从少到多的显著变化。


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Figure 1. DHSs Are Dynamic in Human Early Embryos


DHS的出现跟基因表达一致。启动子上有DHS的基因表达量高,反之亦然。

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DHS大量涌现的8细胞期,大量转录激活的基因主要富集在非常重要的调控和发育过程。


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例如HOX家族基因,从8细胞期开始转录激活

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Figure 2. Chromatin Accessibility Is Associated with Embryo Development

二、ZGA期DHS与OCT4

8细胞期的DHS上的确富集了OCT4

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Figure S5. Motif Dynamics, Related to Figure 3


人类合子基因组激活期,1/4基因的转录激活依赖于OCT4,小鼠则不依赖于OCT4。

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SOX2是OCT4下游的靶基因,起关键调控做用的还是OCT4


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Figure 3. OCT4 Contributes to Human ZGA


三、DHS与DNA甲基化、CpG密度

启动子上有DHS的比没有DHS的基因甲基化水平更低


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Figure 4. DHS Is Associated with DNA Methylation


胚胎发育早期建立DHS的启动子CpG密度高于晚期建立DHS的启动子


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Figure 5. Low-CpG Promoters Tend to Establish DHSs at Later Embryo Stages


四、ZGA期DHS与转座子

DHSs在转座子区域也是逐渐增加的状态


Figure 6. DHSs in Transposon Elements


五、DHS与进化

进化上较老的基因会更早地建立DHS


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Figure 7. Association between Gene Age and Chromatin Accessibility




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