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三代测序

已有 156 次阅读 2017-9-21 09:20 |个人分类:高通量|系统分类:科研笔记

三代测序
1..第一代测序技术
Sanger法核心原理是:由于ddNTP的2’和3’都不含羟基,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
2.第二代测序技术
2.1 Illumine
(1)DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段,目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外,主要是打断成200-500bp长的序列片段,并在这些小片段的两端添加上不同的接头,构建出单链DNA文库。
(2)Flowcell
Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道,当文库建好后,这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel,每个channel的表面都附有很多接头,这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对,并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
(3)桥式PCR扩增与变性
桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板,进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环,最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束,每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝,进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大,以达到测序所需的信号要求。
(4)测序
测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP(如同Sanger测序法)。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护,因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后,所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着,再加入激发荧光所需的缓冲液,用激光激发荧光信号,并有光学设备完成荧光信号的记录,最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后,再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团,以便能进行下一轮的测序反应。
2.2 Roche 454
(1)DNA文库制备
454测序系统的文件构建方式和illumina的不同,它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段,并在片段两端加上不同的接头,或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增,连接载体,构建单链DNA文库。
(2)Emulsion PCR (乳液PCR,其实是一个注水到油的独特过程)
454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同,它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上,并在其上面孵育、退火。
(3)焦磷酸测序
测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠,接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔,每个小孔仅能容纳一个磁珠,通过这种方法来固定每个磁珠的位置,以便检测接下来的测序反应过程。
测序方法采用焦磷酸测序法,将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中,启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板,每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对,则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光,同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录,最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同,因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后,游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP,从而导致荧光淬灭,以便使测序反应进入下一个循环。
2.3 Solid技术
Solid测序技术是基于连接酶法,即利用DNA连接酶在连接过程之中测序。
(1)DNA文库构建
片段打断并在片段两端加上测序接头,连接载体,构建单链DNA文库。
(2)Emulsion PCR
Solid的PCR过程也和454的方法类似,同样采用小水滴emulsion PCR,但这些微珠比起454系统来说则要小得多,只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰,这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中,沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠,在同一系统中轻松实现更高的通量。
(3)连接酶测序(没理解)
这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶,而是采用了连接酶。连接反应中,这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。这个8碱基单链荧光探针中,第1和第2位碱基(XX)上的碱基是确定的,并根据种类的不同在6-8位(zzz)上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法,两个碱基确定一个荧光信号,相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时,就会发出代表第1,2位碱基的荧光信号。在记录下荧光信号后,通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割,这样就能移除荧光信号,以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是,通过这种测序方法,每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位,第二次是第6、7位……在测到末尾后,要将新合成的链变性,洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是,二者在与接头配对的位置上相差一个碱基。也即是,通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置,因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成,依此类推,直至第五轮测序,最终可以完成所有位置的碱基测序,并且每个位置的碱基均被检测了两次。该技术的读长在2×50bp,后续序列拼接同样比较复杂。
2.4 Solexa方法是利用单分子阵列测试 genotypin(SBS)
3. 第三代测序技术
3.1 PacBio SMRT技术(对GC含量的偏向性小)
与前两代相比,他们最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增。
PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想,并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是: DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基(即是dNTP),在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。
测序原理:
1. 用4种荧光分别标记4种dNTP
2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光波长相应的小孔,特定的孔径保证了入射光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物。
3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部
4. 让DNA链与酶结合,进行测序
5. 测序时,荧光dNTP与酶+DNA模板形成复合物,短暂结合
6. 荧光dNTP被激光照射,发出荧光,荧光被检测到
7. 酶反应过程,一方面使链延伸,同时使dNTP上的荧光基团脱落
8. 聚合反应持续进行,测序同时持继进行
BLASRo:PacBio数据比对工具,可以将pacbio的reads比对到比较剪辑错误比较少的序列上,譬如组装出来的contig等。
3.2 纳米孔测序
设计了一种特殊的纳米孔,孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时,它们使电荷发生变化,从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的),灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。
纳米孔单分子测序计算还有另一大特点,它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶,而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%,而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。但目前似乎还没有应用该技术的相关报道。
小结
第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外,其测序核心原理(除Solid是边连接边测序之外)都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降,通量大大提升,但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率,并且具有系统偏向性,同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的,它的根本特点是单分子测序,不需要任何PCR的过程,这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误,同时提高读长,并要保持二代技术的高通量,低成本的优点。




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