• 底物化学计量决定中国南方森林整个演替过程中的固氮作用

• 实验地情况

• 表 1 被研究森林地的一般特征

• 实验设计

• 取样

• 乙炔还原法

• 底物的化学性质

• 数据分析

• 整个演替过程中的固氮、底物氮和磷以及化学计量

• 图 1 整个森林演替中，土壤、森林地面和苔藓固氮率的箱线图

• 图 2 在整个森林演替过程中，不同基质中的N，N：P，C：N和C：(N：P)

• 图 3 整个森林演替过程不同基质中的固氮率与N，P，C：N或C：(N：P)之间的关系

• 图 4 结构方程模型解开了森林演替控制苔藓中固氮的主要途径

• 沿森林年龄梯度的固氮和底物化学计量

• 图5 氮固定率及其与底物化学计量在森林年龄梯度上的关系

• 写在前面

• 摘要

• 背景

• 结果

• 讨论

• 结论

• 材料与方法

• Reference

• 猜你喜欢

• 写在后面

底物化学计量决定中国南方森林整个演替过程中的固氮作用

Substrate stoichiometry determines nitrogen fixation throughout succession in southern Chinese forests

Impact Factor：8.699

DOI：https://doi.org/10.1111/ele.13437

发表日期：2019-12-04

第一作者：Mianhai Zheng^1,2,3,4

通讯作者：Jiangming Mo(mojm@scib.ac.cn)^1,2,3*

合作作者：Hao Chen,Dejun Li,Yiqi Luo

主要单位：

¹中国科学院华南植物园，退化生态系统植被恢复与管理重点实验室(Key Laboratory of Vegetation Restoration and Management of Degraded Ecosystems, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

²中国科学院核心植物园植物生态中心(Center for Plant Ecology, Core Botanical Gardens, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

³中国科学院华南植物园，广东省应用植物学重点实验室(Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

⁴中国科学院大学(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

写在前面

分享标题：EL：谁说N素含量高就不固氮了(本研究反而“多多益善”)

关键字：非共生固氮，森林演替，氮含量，磷限制，化学计量，底物

点评：本研究更新了我们先前对最高固氮率发生在早期或中期演替森林(土壤受到N限制)中的认识，提出了森林演替通过改变资源化学计量数而不是单一资源来刺激固氮，强调了在整个森林动态中，固氮速率同时受底物C，N和P共同控制，即基质化学计量比单个养分可以更好地预测固氮速率。揭示了在整个演替和林龄中驱动N固定的关键机制，即与底物N和N：P相比，不稳定的底物C的迅速增加，有利于固氮菌生长，并有助于了解长期存在的氮素反常现象，即富含土壤氮的热带森林维持着氮素循环的上调。总之，本研究强调了生态化学计量学在阐明森林演替和氮循环耦合机制中的作用。

摘要

传统观点认为，生物固氮(N)常在早期或中期的演替生态系统中达到高峰，并在整个演替过程中下降，这是基于土壤氮丰富和/或磷(P)耗竭不利于N固定的假设。然而，这一观点并不能支持这样一种观点，即尽管存在富含氮和/或磷限制的土壤，但固氮菌仍能在许多古老的森林中保持活性。在这里，我们发现在中国南部的三个演替森林和六个年龄梯度森林中，土壤，林地和苔藓中的固氮率出乎意料地增加。我们进一步发现，固氮的变化是由底物碳(C)：N和C：(N：P)的化学计量控制的，而不是由底物N或P控制的。我们的发现强调了生态化学计量学在阐明森林演替和氮循环耦合机制中的实用性。

背景

生物固氮是大气中新的氮输入到陆地和水生生态系统的重要途径，在全球生物地球化学循环中具有生态学意义。一般来说，氮固定可以由占据植物根瘤的微生物(如Rhizobia 与 Frankia)、生活在土壤和凋落物层、冠层叶片和海洋沉积物中的异养菌或与陆生附生植物和海洋浮游植物建立互利关系的蓝藻进行。重要的是，固氮微生物为植物和微生物提供了有效的氮，并减轻了许多生物群落中的氮限制，例如森林，草原，冻原，沙漠和海洋。由于N可以广泛限制整个生态系统的净初级生产力(NPP)，因此通过生物固定的N输入增加了生态系统的固C和NPP，并有助于限制大气中的CO₂浓度。尽管固氮在地球生态系统中很重要，但我们对固氮如何随着演替和/或生态系统发展而变化以及潜在控制措施的了解仍然很有限，这限制了我们在变化的世界中估算和预测全球C–N循环和NPP的能力。

传统的演替理论认为，生物固氮(例如在豆科植物、附生植物和腐烂的木材中)在演替早期或中期的生态系统中表现出最高的速率，并随生态系统的成熟而下降。这一观点是建立在生物地球化学理论的基础上的，该理论认为，氮限制了植物的生长，并在早期演替的陆地生态系统中产生了高氮保留(养分保留假说)，而富含土壤氮(由于长期固定和/或沉积)的后期演替生态系统对外源氮的需求较少(N饱和理论)。从理论上讲，在富氮条件下，固氮菌面临着被非固氮菌淘汰的风险，因为固定大气中的氮气是高耗能过程。许多研究发现，豆科植物和固氮菌在整个演替过程中会下调固氮率，尽管有一些例外。

有两个机制假设支持固氮在整个演替过程中下降的观点。首先，森林发展导致土壤N素富集，这不利于固氮菌(N丰富假设)。由于固定大气中的N₂比土壤吸收N所需的能量更高昂，当土壤N充足时，兼性固氮菌通常会降低固氮速率，而专性固氮菌总是会被非固氮菌取代，而无论土壤N是否丰富。第二，森林的发展(如初级演替和次级演替)导致土壤P的耗竭，从而限制了N的固定(P限制假说)。磷对于固氮菌的生长(例如核糖体，蛋白质和磷脂的生物合成)以及支持固氮的三磷酸腺苷(ATP)的生成很重要。然而，由于生物吸收、水文损失、向封闭形态的转化以及长期N沉积引起的土壤酸化，土壤P随着时间的推移而受到限制，从而限制了N的固定。尽管这些假说支持了在整个演替过程中N固定下降的观点，但它们不能解释固氮菌(即固氮微生物和附生植物)在土壤N含量丰富或土壤P含量稀少的古老森林中仍然活跃的现象。这个现象表明我们对整个森林演替过程中控制N固定的机制的认识仍不完全。

资源化学计量学在微生物的生长和功能中起着至关重要的作用。与单一资源(如N)相比，资源化学计量(如C:N或N:P)有时可以更好地预测N的固定率。一个典型的例子是来自新西兰一个12万年时间序列的案例研究，其中凋落物，苔藓植物和蓝藻中的固氮不受土壤氮库的影响，并表现出一种“非硝基动态”(即，尽管土壤氮含量丰富，但固氮菌保持了较高的固氮率)。一种可能的机制是冠层和凋落物中的固氮菌与土壤氮池解耦，这创造了有利于固氮的氮素贫乏的条件(植物组织相对分解者具有较高的C：N比)，尽管土壤氮素丰富。此外，已有研究发现，不稳定C含量高但总N含量低的凋落叶中，其较高的C:N比的资源有利于凋落层中N的固定。尽管这些重要的发现和假设表明，资源C: N比控制了垂直梯度上的N固定(空间尺度)，但我们关于资源C: N对整个演替动态(时间尺度)中固氮影响的认识仍然相对有限。鉴于森林演替不仅会改变底物C和N，而且会改变P的有效性，并且固氮菌的生物量和固氮过程需要C，N和P的参与，因此可能会引入一个包含C、N和P的变量，其可能在整个演替过程中控制着固氮率(化学计量假设)。

我们的研究旨在解决森林演替如何调控固氮作用，并探索这种调控的潜在机制。由于森林演替涉及到物种更替和相关的变化(如资源、生物量和林龄的增加)，所以我们在中国南方的三个演替林(发生树种更替的地方；实验1)和6个年龄梯度的森林(土壤C和N资源以及微生物和植物生物量增加的地方;实验2)进行试验。鉴于植物和土壤中氮的浓度在整个演替过程中可能会增加(通过氮的沉积和固定)，这可能会改变底物C和P的有效性以及化学计量，因此我们采用了长期(3到13年)的氮添加处理(0到150Kg N/公顷/年)来探索是否资源有效性或化学计量控制固氮。我们假设(H1)固氮在整个演替过程中会下降，因为固氮菌在后期的演替生态系统中竞争优势较小；(H2)单一养分(即N或P)的有效性可以解释N固定的变化，因为森林演替会导致土壤N丰富(N富集假设）和/或P限制(P限制假设)；和(H3)资源化学计量(即C:N或C:(N:P))可能比单一资源更好地预测N固定，因为N固定可能受到C，N (C:N化学计量假设)和P(C:(N: P)化学计量假设)的共同调节。

结果

整个演替过程中的固氮、底物氮和磷以及化学计量

N fixation, substrate N and P, and stoichiometry throughout succession

晚期演替期森林的单位质量固氮率高于早期演替期和中期演替期(F_2,42=4.58 P=0.016, F_2,42 = 7.87 P=0.001, F_2,42 = 27.85 P<0.001，分别对于土壤、林地和苔藓;方差分析;图1)。同样，在晚期森林演替中的单位面积内的N固定率高于早期和中期(F_2,42 = 4.32 P = 0.020, F_2,42 = 3.94 P = 0.027, F_2,42 = 16.07 P < 0.001，分别对应于土壤、森林地面和苔藓;方差分析)。晚期演替森林的总N固定率(2.9±0.2 mg N m⁻² day⁻¹)高于早期演替森林(2.2±0.1 mg N m⁻² day⁻¹)和中期演替森林(2.3±0.1 mg N m⁻² day⁻¹)(F_2,42 = 8.65 P = 0.001;方差分析)。

图 1 整个森林演替中，土壤、森林地面和苔藓固氮率的箱线图

Box figures of nitrogen fixation rates in the soil,forest floor,and moss throughout forest succession

在整个森林演替(从早期到后期的演替森林)中，土壤(单位质量)(a)、森林地面(b)和苔藓(c)固氮率的箱线图。每个框代表下四分位数和上四分位数，中位数和均值分别显示为中心线和实心圆。不同的大写字母代表森林之间的差异显着(n=15，P<0.05)。在本研究中，早、中、晚演替期森林分别代表针叶林、针叶阔叶混交林，以及阔叶林。

底物N的浓度，N：P(即总N浓度除以总P浓度)，C：N(即总C浓度除以总N浓度)和C：(N：P)(即总C浓度除以总氮与总磷浓度的商)在整个演替过程中都发生了变化(从针叶林到阔叶林；图2)。具体而言，在整个演替过程中，土壤和苔藓中的氮浓度增加(F_2,42 = 57.62 P<0.001和F_2,42 = 10.88 P<0.001分别；方差分析)，而森林地面的N浓度没有变化(F_2,42 = 1.60 P=0.214;方差分析)。在整个演替过程中，森林地表和苔藓C：N增加(F_2,42 = 3.70 P = 0.033 and F_2,42= 10.55 P < 0.001, 分别；方差分析) ，但土壤C：N减少(F_2,42= 4.61 P = 0.015; 方差分析)。底物N：P(对于土壤和森林地面分别为F_2,42 = 5.51 P = 0.007和F_2,42 = 3.35 P = 0.045;方差分析)和底物C：(N：P)(对于土壤，林地和苔藓分别为F_2,42 = 3.36 P = 0.044，F_2,42 = 3.79 P = 0.031，F_2,42 = 3.46 P=0.041;方差分析)在整个演替过程中不断增加，这表明与底物N：P的比相比，底物C(特别是不稳定的C，例如易氧化的C(ROC)，MBC和溶解性有机C(DOC))的浓度迅速增加。底物C：(N：P)的增加还表明，提高C的可用性对固氮菌的潜在影响可能大于底物N富集和P限制的潜在影响，这可能会在整个演替过程中推动N的固定(化学计量学假说)。

图 2 在整个森林演替过程中，不同基质中的N，N：P，C：N和C：(N：P)

Nitrogen,N : P,C : N, and C : (N : P) in different substrates throughout forest succession

在整个森林演替(从早期到后期的演替森林)中的不同基质(土壤、森林地面和苔藓)中的N,N:P,C:N,及C:(N:P)(a‒d)。每个框代表上下四分位数，中位数和均值分别显示为中心线和实心圆。不同的大写字母表示森林之间的差异显著(n=15，P<0.05)。在本研究中，早、中、晚演替期森林分别代表针叶林、针叶阔叶混交林，以及阔叶林。

底物N和P在整个演替过程中都不影响N的固定率，因为线性回归模型显示，N和P都不能解释对照地或N添加地块中每种底物内N固定率的变化(P＞ 0.05；图3)。底物C: N和C:(N: P)分别解释了对照地块内12-25%和29-39%的固氮的变化(P≤0.01;图3c,d)，及N‐添加地块内12-20%和17-36%的固氮的变化(P≤0.01;图3g,h)。在氮添加的处理下，尽管底物C：N(∆C：N)和C：(N：P)(∆C：(N：P))的响应比在整个演替过程中均发生变化，但底物∆C:N和∆C:(N：P)与∆N固定呈正相关关系(r²= 0.66,P=0.005, r²=0.57,P=0.01;图3 k, l)。

图 3 整个森林演替过程不同基质中的固氮率与N，P，C：N或C：(N：P)之间的关系

Relationships between nitrogen fixation rates and N, phosphorus, C: N, or C : (N : P) in different substrates throughout forest succession

在整个森林演替过程中，氮(N)固定率(单位质量)与氮，磷(P)，C:N或C：(N：P)在不同底物(土壤，森林地面和苔藓)之间的关系。对照地块每种底物中N，P，C：N或C：(N：P)的N固定率的线性回归模型(n=45)(a‒d)。氮添加地块每种底物中N，P，C：N或C：(N：P)的N固定率的线性回归模型(n=45)(e‒h)。添加N后固氮率对N，P，C：N或C：(N：P)的响应比的线性回归模型(注意：每个底物内的三个实心点(带有误差线)代表三个森林；n=9)(i‒l)。每个实点和误差线分别表示添加N后的平均响应率和95％的置信区间。

结构方程模型表明森林演替通过底物化学计量控制固氮作用(图. 4)。具体而言，森林演替直接刺激了苔藓的固氮作用(解释了58‒60％，P<0.001)，并通过改变苔藓的C：N或C：(N：P)间接刺激了苔藓固氮作用(19‒20％，P≤0.002)，并且森林演替通过同时改变苔藓N和C：N(或C：(N：P))间接抑制了苔藓N的固定(9‒10％，P≤0.009；图4a，b)。森林演替通过改变林底C：N和C：(N：P)(43‒50％，P <0.001)和改变林底N(11％，P≤0.015)间接刺激林底N的固定，森林演替通过改变林底N和C：N来间接抑制林底N的固定(15％，P≤0.007；图4c，d)。森林演替通过改变土壤C：(N：P)间接刺激土壤固氮(44％，P <0.001)且森林演替通过改变土壤P(40％，P≤0.009)和改变土壤N和C：N(或C：(N：P))间接抑制土壤固氮(54‒61％，P<0.001；图4e，f)。

图 4 结构方程模型解开了森林演替控制苔藓中固氮的主要途径

Structural equation models disentangling the major pathways of forest succession controlling nitrogen (N) fixation in the moss

结构方程模型解开了森林演替控制苔藓(χ2 = 0.69, d.f. = 2, P = 0.71, RMSEA < 0.001, (a); χ2 = 0.29, d.f. = 1, P = 0.59, RMSEA < 0.001, (b)), 森林地面 (χ2 = 1.35, d.f. = 1, P = 0.25, RMSEA < 0.001, (c); χ2 = 0.49, d.f. = 1, P = 0.48, RMSEA < 0.001, (d)), 及土壤中(χ2 = 0.25, d.f. = 2, P = 0.29, RMSEA < 0.001, (e); χ2 = 0.01, d.f. = 1, P = 0.98, RMSEA<0.001,(f))固氮的主要途径。连续箭头和虚线箭头分别代表显著(P<0.05)和非显著(P≥0.05)的途径。箭头上的值表示标准化的路径系数，与箭头的宽度成比例。正值和负值分别表示正相关和负相关。r²表示模型解释的固氮的变化。

沿森林年龄梯度的固氮和底物化学计量

N fixation and substrate stoichiometry along forest age‐gradient

通常，固氮率(单位质量；此后)随着森林年龄梯度的增加而增加(图5b)。在>400年的阔叶林中，苔藓固氮率最高，其次是80年的针叶/阔叶林，80年的针叶林和50年的阔叶林(F_3,8=104.83，P<0.001；方差分析)，而苔藓在30年的洋槐人工林和30年的桉树人工林中均不存在。>400年阔叶林的森林底面N固定率最高，其次是80年的针叶/阔叶林、80年的针叶林、50年的阔叶林、30年的洋槐人工林和30年的桉树人工林(F_5,12=39.72,P<0.001;方差分析)。在>400年的阔叶林中，土壤固氮率最高，其次是80年的针叶/阔叶林，80年的针叶林，50年的阔叶林，30年的桉树人工林和30年的洋槐人工林(F_5,12=48.72,P<0.001;方差分析)。单位面积固氮率与单位质量固氮率显示出相似的模式，总固氮率沿森林年龄梯度从1.1 mg N m⁻²day⁻¹增加到2.9mg N m⁻²day⁻¹。

图5 氮固定率及其与底物化学计量在森林年龄梯度上的关系

Nitrogen fixation rates and their relationships with substrate stoichiometry along forest age‐gradient

六个森林地点的位置(a)。六个森林中土壤，林地和苔藓中固氮率的堆积柱状图(b）)。不同的小写字母(在每个底物内)表示森林之间差异显著(n=3，P<0.05)。图(b)中的白线表示y轴的中断，这使得每一列都可见。对照小区各基质中C: N和C: (N: P) 与N固定率的线性回归模型(对于土壤和森林地面，n=18，对于苔藓，n=12，因为在两个HS人工林中很少见苔藓)(c，f)。N‐添加区的每个基质中C:N和C:(N:P)与N固定率的线性回归模型(对于土壤和森林，n=18，对于苔藓，n=12)(d，g)。添加N后N固定率对C：N和C：(N：P)响应比的线性回归模型(注意：每个底物内的六个实点(带有误差线)代表六个森林(苔藓除外，仅在四个森林中出现))(e，h)。每个实点和误差线分别表示添加N后的平均响应率和95％置信区间。HS，鹤山研究站；SMT，石门台自然保护区；DHS，鼎湖山生物圈保护区。

结果表明，在整个演替过程中，N固定受资源化学计量(即C: N和C: (N: P))的影响，而不是受N或P的影响(图 3)，本研究还发现，N固定率受森林年龄梯度上的资源化学计量的调节(图 5)。线性回归模型显示，底物C:N可以解释氮添加区24-29%(P≤0.04)的N固定变化(图5d)，且底物C:(N: P)分别解释了对照区和N添加区N固定变化的24-44% (P≤0.02)和27-52%(P≤0.04)(图5f,g)。在N‐添加处理下，底物的∆C: N和∆C: (N: P)与∆N固定呈正相关(r²=0.74，P<0.001和r²=0.51，P<0.001;图5e，h)。

讨论

与我们的假设相反，即N固定可能会在整个演替过程(H1)中下降，我们发现，在所有基质中，N固定率在演替过程中均呈上升趋势，在后期演替森林中(图1)达到峰值，此时土壤已处于N饱和状态。这一发现扩展了之前的一些研究发现，即在森林火灾后，苔藓内的N固定率随着森林的恢复而增加(但土壤中仍有N的限制)，并且相反与许多先前的发现，即在整个演替过程中固氮率下降或保持恒定。我们的发现扩展了氮固定在早期或中期的生态系统中达到峰值的传统观点和经验证据，并支持了之前的假设和观察，即固氮菌在许多古老的富含氮的森林中仍然活跃，从而保持了森林的氮素丰富性。

与先前的理论和观察结果一致，我们发现底物N和N：P在整个演替过程中增加(图2)。这项发现与我们先前在研究的后期演替森林中净生态系统氮损失和明显的微生物磷限制的发现相结合，表明森林演替导致土壤氮富集和磷限制。但是，我们的回归模型表明，底物N和P都不能解释N固定的变化(图3)，这不支持我们的假设(H2)。即使经过氮添加处理，我们也没有发现证据表明固氮变化是由每种基质(土壤，林地和苔藓)中氮或磷的变化引起的(图3)。这些结果与Menge＆Hedin先前的发现一致，即在凋落物，地衣和苔藓植物中的固氮不受沿土壤时间序列的土壤氮丰度的影响。我们的发现相反与以前的观点和发现，即在森林演替过程中，高N或低P的可用性限制了N的固定，并表明在整个演替动态过程中，N的固定不受底物N(N富集假设)或P(P限制假设)的控制。

我们提出两个理由来解释为什么我们的结果与先前的知识相矛盾。首先，演替过程中N固定下降的传统观点和假设机制来源于植物根瘤中的共生固氮，并将其应用于植物根瘤中的共生固氮。从理论上讲，固氮植物可以在土壤氮充足的情况下减少根瘤生产和固氮的能源成本，这使它们可以投入更多的能量来获取有限的营养。因此，土壤中的氮丰富和磷的限制常常导致根瘤N固定能力的下降。与由固氮植物有效控制的根瘤固氮不同，自养固氮微生物(例如蓝细菌)进行的固氮主要依赖于蓝细菌的光合作用或寄主植物的C库，而异养固氮微生物进行的固氮大大的依赖于环境中的有机物。因此，氮固定微生物可以在高碳量和高质量的基质中维持高的固氮率。

其次，固氮微生物的生长和功能不仅受氮和磷的调节，而且还受碳有效性的影响(化学计量原理)，因此资源化学计量比单独的氮或磷可以更好地预测固氮率。在一些成熟的森林中发现了经验证据，这些森林的基质(如落叶层、树叶和/或附生植物)具有高的不稳定性C含量，但总氮含量低(即高C: N的化学计量)，尽管土壤氮含量丰富，磷含量有限，但仍表现出较高的氮固定率。我们的研究发现，不稳定的底物C(如ROC、MBC和DOC)浓度在整个演替过程中不断增加，与N固定率增加的模式相似(图1)。这些证据一起表明，有关演替理论中N固定的传统观点和假设可能已经忽略了基质C可用性的重要性。

由于高C(例如不稳定C)，高P和低N浓度的底物有利于固氮，因此我们假设底物C：N或C：(N：P)可能比底物N或P更好地解释了整个演替过程中N固定的变化(H3)。我们的结果支持了这一假设。首先，我们发现不稳定碳浓度在整个演替过程中随总碳浓度成比例的增加，且增加的不稳定碳的响应比高于由N累积驱动增加的N：P比。其次，我们的回归模型表明底物的N和P与固氮率无关，而底物的C：N和C：(N：P)解释了12％至66％的固氮变化(图3)。第三，我们的结构方程模型表明，森林演替主要通过增加底物C：N(r²=20-43％)和C：(N：P)(r²=19-50％)来刺激固氮(图4)。第四，我们发现森林演替同时改变了所有资源(尤其是C)的浓度，而不是单独改变了N或P的浓度。这些发现表明，森林演替通过改变资源化学计量而不是单一资源来提高固氮率，这为演替理论提供了新的见解，并促进了我们对演替过程中N固定是由基质C、N和P共同调节的认识。

此外，我们提出了一个概念框架来解释我们的发现，即在演替过程中，底物的化学计量驱动N固定率的增加。在早期演替性森林中，尽管低氮和高磷有效性的基质有利于固氮菌，但低碳(例如不稳定的C)有效性的基质却抑制了固氮。因此，低的底物C：N或C：(N：P)的化学计量限制了早期演替过程中的N固定。随着氮的累积(通过氮的沉积和固定)和磷的消耗(由于生物的吸收和淋失的损失)，演替中期森林的植物种类和生物量增加，导致了底物总C(包括不稳定C)的增加，从而导致N固定率的增加。因此，在中期演替阶段，底物的C：N或C：(N：P)的化学计量增加刺激了N的固定。在后期的森林中，尽管土壤中氮的富集或磷的限制不利于固氮菌，但凋落物和冠层中的固氮作用与土壤氮库的耦合作用减弱，受土壤氮库控制的程度较低，而基质C的高有效性成为固氮的关键驱动力。因此，在晚期演替阶段，高的底物C：N或C：(N：P)的化学计量比支持固氮(图3)。

以上发现和概念框架在我们的年龄梯度森林中得到了证实。我们发现，由于基质中C：N和C：(N：P)的增加，N固定率(单位质量和单位面积)随着森林年龄梯度(从幼林到老林)的增加而增加(解释了N固定变化的24％至74％；图5)。该证据支持了我们的发现，即森林演替动态通过底物化学计量的变化来驱动固氮，并强调了在演替过程中固氮是由C，N和P共同调控。然而，在演替期间，人工林的行为可能不像天然森林。我们的年龄梯度森林(包括幼龄人工林)只代表林龄不同的森林，而不是自然演替梯度的森林，未来需要更多的相关研究来验证这些发现。结合以前的发现，非共生固氮菌在老林中保持高的固氮率，我们得出的结论是，固氮作用在维持后期演替森林中土壤氮素丰富度方面起着重要作用，这挑战了传统的观点(即，固氮峰值出现在土壤受氮素限制的早期或中期演替的生态系统中)，并为演替理论提供了新的见解。

结论

本研究发现，森林演替通过改变资源化学计量数而不是单一资源来刺激固氮，这对理论生态学和应用生态学有三方面的意义。首先，我们的发现提供了重要的证据，表明在整个森林演替过程中以及沿着森林年龄梯度的所有试验底物中，无论土壤氮含量和磷含量的限制如何，氮固定率都在增加。这些结果更新了我们先前对最高固氮率发生在早期或中期演替森林(土壤受到N限制)中的认识，这是由演替理论预测的，并得到了许多经验研究的支持。其次，我们没有证据表明在整个演替动力学过程中，任何基质中的固氮都受到N或P的控制，这扩展了先前的假设和建模结果，即冠层和枯枝落叶层中的固氮菌与土壤N素的丰富度解耦且受其控制较少。第三，我们的研究揭示了在整个演替和林龄中驱动N固定的关键机制，即与底物N和N：P相比，不稳定的底物C迅速增加，有利于固氮菌。这种化学计量的机制表明，在整个森林动态中，固氮速率同时受基质C，N和P共同控制，这支持了以前的观点，即基质化学计量比单个养分可以更好地预测固氮速率，并有助于了解长期存在的氮素反常现象，即富含土壤氮的热带森林维持着氮素循环的上调。总之，本研究突出了生态化学计量在阐明森林演替和氮循环耦合机制中的作用。

材料与方法

实验地情况

Site description

我们在位于中国南方广东省(112°10′E，23°10′N)的鼎湖山(DHS)生物圈保护区进行了第一个实验(森林演替实验；实验1)。共有三种森林处于不同的演替阶段：针叶林(早期演替)，针叶和阔叶混交林(以下简称针叶/阔叶林;演替中期)和阔叶林(演替后期)。针叶林以拓荒树种马尾松为主。由于阔叶树种的自然更新和入侵，原先以马尾松属（P.massoniana）为主的针叶林/阔叶林，现在以针叶树种(P.massoniana)和阔叶树种(Castanopsis (C.) chinensis和Schima (S.) superba为主。阔叶林经历了长期演替，并完全被原生阔叶林物种(例如 C. chinensis，S.superba，Machilus chinensis和Cryptocarya chinensis)所主导。我们森林演替系列的特征是原生物种替代(从针叶树种到阔叶树种；表1)。

表 1 被研究森林地的一般特征

General characteristics of the studied forest sites

注释带有*，†，‡，＃、、§，'标签的数据来自Zhang等人的表格或数字。N：氮； C：碳； P：磷；MBC：微生物生物量碳；DBH：山峰高度的直径； MAT：年平均气温； MAP：年平均降水量；DHS:鼎湖山生物圈保护区；HS：鹤山研究站；SMT：石门台自然保护区。 DHS1和DHS2代表了鼎湖山生物圈保护区的不同研究地点。‘+ N50’和‘+ N150’分别表示每年50Kg和150Kg/ha的氮添加量。

我们在中国南方广东省的三个地点进行了第二个实验(森林年龄梯度实验；实验2)：鹤山(HS)国家野外研究站(112°50′E，22°34′N)，石门台(SMT)国家自然保护区(113°05'‒113°31'E，24°22'‒24°31'N)和DHS生物圈保护区(112°10'E，23°10'N)。这三个地点的季风气候相同，水热条件相似(表 1)。在HS站点上，我们选择了30年的桉树(Eucalyptus urophylla)人工林和30年的金合欢树(Acacia auriculiformis)人工林，这些人工林于1984年在退化的草地上建立。在SMT场地，我们选择了一个有50年历史的常绿阔叶林，该林原本是1965年的石灰石工厂。在DHS站点，我们选择了一个80年树龄的针叶林和一个80年树龄的针叶林/阔叶林，它们建立于1930年的退化土地上，且我们选择了一个> 400年树龄的阔叶林，它从1633年起就受到了保护(为此实验选择的DHS森林地点靠近实验1)。为了区分实验1和实验2的不同研究地点，我们分别将它们标记为DHS1和DHS2(表 1)。土壤资源(例如碳和氮)，微生物生物量(例如MBC)和植物生物量(例如DBH)随着森林年龄梯度的增加(从30年增加到> 400年；表1)而增加。

实验设计

Experimental design

实验1于2007年2月在DHS1站点启动，添加了两个水平的氮(每个水平重复五次)：0和150 kg N ha^-1year^-1。每个5×5 m²的地块都被5 m宽的缓冲带包围，并且所有地块都随机布置在每个森林中。从2007年2月至2016年7月，每两个月使用背包式喷雾器将NH<ub>4NO₃溶液喷洒在冠层下。每个氮添加区都将肥料与5升水混合，每个对照区都接收5升水。

实验2分别于2003年7月，2010年8月和2013年4月在DHS2，HS和SMT站点启动，分别添加了两个水平的N(每个水平重复三次)：0和50 kg N ha^-1year^-1。每个方形地块(HS和DHS2场地分别为10×10m和10×20m)或圆形地块(SMT场地面积为907平方米，半径为17米)被10余米宽的缓冲带包围。在SMT场地，从2013年4月到2016年7月的生长季节(4月到10月)，在氮添加地块的冠层下方每月施用相当于3mm降水量的NH<ub>4NO₃溶液。在HS(2010年8月至2014年7月的每两个月)和DHS2(2003年7月至2015年7月的每两个月)的N添加田中，使用背包式喷雾器将混合有10 L和20 L水的肥料(NH₄NO₃)喷洒到树冠下的位置，并在对照区喷洒等量的水。

取样

Sampling

分别于2016年7月在DHS1站点和2014年7月，2015年和2016年在HS，DHS2和SMT站点进行了现场采样。使用金属框(20×20 cm²)从每个样地中随机收集三到五个森林地面样本，包括精细的木质组织，新鲜和腐烂的叶子。利用2.5厘米的土壤取芯器，将森林地面下的矿物土收集到10厘米深的地方。通过在每个样地中刮擦3至12块5×5cm²的碎片，收集分布在树干底部或石头表面的固氮苔藓。称量所有样品的重量，并将其烘干以测定水分含量。

乙炔还原法

Acetylene reduction assay

用乙炔还原法测定固氮率。具体来说，将新鲜样本(5-6克森林地被物，10-13克土壤，或3-4克苔藓)密封在120‐mL气密玻璃罐中，其中10%的顶空被纯C₂H₂(99.99%)取代。样品在原位培养7-24小时，以接近环境光和温度条件。孵育后，对每个广口瓶中的顶空气体进行采样，并将其存储在12mL抽真空的Exetainer中(Labco，High Wycombe，英国)，然后返回实验室进行分析。使用气相色谱仪测量每种气体样品的C₂H₄浓度。测量并减去纯C₂H₄气体中的背景C₂H₄浓度和样品自然产生的C₂H₄浓度。单位质量的固氮率表示为C₂H₄的生产率(nmol C₂H₄ g^-1干重h^-1)，并且使用C₂H₄的生产率，固定存量和转化率来提高单位面积的固氮率。

底物的化学性质

Substrate chemical properties

总C浓度通过用Fe²⁺溶液进行重铬酸钾氧化滴定法来测量。使用微凯氏消化，并分别使用吲哚酚蓝比色法和Mo‐Sb比色法测量总N和总P的浓度。

数据分析

Data analyses

检验数据的正态性(Kolmogorov-Smirnov检验)和方差齐性(Levene检验)。采用单因素方差分析(anova)和Tukey’s HSD检验确定森林演替和年龄梯度对基质N固定率(N、N: P、C: N和C: (N: P)的影响。使用线性回归模型探讨固氮率与底物N，P，C：N或C：(N：P)之间的关系以及氮素添加后固氮与底物N，P，C:N，或C:(N:P)的响应比之间的关系。结构方程模型被用来量化森林演替效应对N固定的直接和间接途径的相对重要性。使用SPSS19.0执行方差分析和线性回归模型，并使用AMOS21.0执行结构方程模型。统计学上的显著性差异被确认为P<0.05。

Reference

Mianhai Zheng,Hao Chen,Dejun Li,Yiqi Luo,Jiangming Mo. Substrate stoichiometry determines nitrogen fixation throughout succession in southern Chinese forests. Ecology Letters, (2020) 23: 336–347 https://doi.org/10.1111/ele.13437

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