钼限制了热带森林土壤的非共生固氮

Molybdenum limitation of asymbiotic nitrogen fixation in tropical forest soils

Nature Geoscience [IF:14.48]

DOI: https://doi.org/10.1038/NGEO366

第一作者：Alexander R. Barron¹

通讯作者：Lars O. Hedin(lhedin@princeton.edu)^1*

合作作者： Nina Wurzburger, Jean Phillipe Bellenger, S. Joseph Wright,
Anne M. L. Kraepiel

主要单位：

¹ 美国普林斯顿大学生态与进化生物学系(Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University, Guyot Hall, Princeton, New Jersey 08544, USA)

写在前面

分享标题：透过现象看本质：到底谁才是限制非共生固氮的幕后主使

关键字：非共生固氮、微量营养元素、固氮酶活性、重过磷酸钙

点评：尽管热带森林在全球生物地球化学循环中具有重要作用，但人们对这些系统中控制固氮的因素知之甚少。观察到高度风化的热带土壤缺乏从岩石中获得的营养物质，这使人们想到固氮可能受到大量营养素的限制，特别是磷(P)。由于钼通常作为微量污染物出现在磷肥中，对于固氮率到底是受Mo的限制还是P的限制或是受二者的共同限制这一问题，作者经过精心设计实验，得出结论，固氮率受钼的限制，而不受磷的限制，只是因为钼构成了一种“隐性处理”，足以在施磷肥料区造成磷限制的表象。由于商品肥料被广泛用于实际生产中，以前的研究可能误解了这种明显的P效应。

摘要

固氮是分子氮转化为植物可利用的铵态氮的过程，从局部到全球范围，是氮对生态系统的主要自然输入形式，影响着植物生长和碳交换。在热带森林中这一过程所起的作用尤其令人关切，因为这些生态系统中有大量的固氮生物，且占陆地初级生产者的三分之一。我们发现微量营养元素钼（固氮酶的辅助因子）限制了巴拿马低地森林土壤中独立生存异养菌的固氮作用。我们分别测量了固氮作用在整个森林中对长期养分处理和在土壤微环境中对短期养分处理的反应。单独钼处理、微量营养元素处理(包含钼)和商业磷肥处理(其中钼是一种“隐性”污染物)的固氮量急剧增加。未受钼污染的磷的施用对固氮作用无影响。我们的研究结果表明，钼可以限制热带森林中的非共生固氮，并对钼和磷在热带氮循环中的作用提出了新的问题。我们认为，钼的限制可能在强酸性风化土壤中普遍存在，并可能限制一些森林在应对CO₂肥时获得新氮的能力。

正文

尽管热带森林在全球生物地球化学循环中具有重要作用，但对这些系统中控制固氮的因素知之甚少。观察到高度风化的热带土壤缺乏从岩石中获得的营养物质，这使人们想到固氮可能受到大量营养素的限制，特别是磷(P)。然而，来源于岩石的微量营养素，如钼(Mo)在这种环境中可能是一个不受重视的因素。Mo是最常见的固氮酶的关键组成部分，已被证明其限制了农业豆科植物的固氮，限制了太平洋西北部一些土壤的异养固氮，并被认为限制了在CO₂升高下的固氮。在许多酸性的热带土壤中，钼的供应尤其不足，在那里，风化和浸出作用会随着时间的推移而消耗微量元素。氧化性土壤中Mo的主要无机形态是钼酸盐(MoO₄^2-)，钼酸盐与铁氧化物和有机质相互作用，可大幅度降低Mo的生物有效性，尤其是在酸性条件下。在独立生存的固氮菌中存在一个高亲和力的Mo摄取系统，这暗示了Mo效应的潜力，除了P的添加外，来自田间的混合微量营养物质的添加，增加了夏威夷一些土壤中的固氮酶活性。然而，还没有直接的试验证明Mo是热带土壤固氮的限制因素，也没有解释为什么固氮菌对分别添加的微量营养素和磷有积极的反应。

我们研究了自由生活的异养菌(以下简称固氮菌)在热带风化土壤中的固氮作用，以及检验钼和其他营养物质是否限制了固氮速率。我们在巴拿马巴罗科罗拉多自然保护区(Barro Colorado Nature Monument)甘加特半岛(Gigante peninsula)具有多样性植物(300多种树种)的成熟低地雨林中进行了补充实验。土壤是高度风化的酸性氧化土，具有世界范围内广泛的热带森林的典型特征。我们的测定结果表明，异养固氮几乎只发生在土壤有机质含量最高的凋落物层(O_i层)，其特征是氮、钼的总含量相对于碳含量较低。(表1)。

表1：土壤总碳、养分含量和摩尔比

本试验中O_i层(凋落物层)样品的总养分含量。LT:长期施肥点的凋落物。值为均值(±s.e.m:);样本大小列在最后一栏。

我们使用两种方法来评估潜在的Mo限制。第一种方法，我们检测了在重复的大面积(1,600 m²)森林地块中，长期遭受(7年)添加N(+125 kg N ha⁻¹ yr⁻¹ 如 尿素)、P (+50 kg P ha⁻¹ yr⁻¹ 如 重过磷酸钙) 或微量营养素(Mo, S, Cu, B, Fe, Mn, Ca 和
Mg; +0.01 kg Mo ha⁻¹ yr⁻¹)处理的野外O_i层潮湿样品的固氮酶活性。第二种方法，我们直接管理未经处理土壤O_i层的Mo和P水平，并记录了添加12小时后的固氮酶活性。我们使用乙炔还原活性(ARA)的标准测定法来估计固氮酶活性，该测定法是根据我们在研究地点测量摄取的¹⁵N₂来校准的。叶面化学(包括木质素)的变化曾被认为会影响氮的固定，但其确切影响难以量化，因为氮的有效性等因素往往不是独立变化的。在我们所有的研究地点，凋落物都来自于本地植物物种的异质组合，它们在独立于处理的叶面化学(包括木质素)中广泛分布。

长期施用氮、磷和微量元素可以使土壤O_i层中氮、磷和钼的丰度发生明显变化，微量元素和磷处理均使土壤中钼的含量增加(表1, p < 0.001; t-test; n = 8, 16)。这些处理显著影响了固氮酶活性(图. 1a;
p < 0:0002, 方差分析 (ANOVA); 每个处理4个地块;
每个地块测量10次)，在接受微量营养素或P处理的试验田中，固氮酶活性比背景值高出2至3倍。(p < 0:013 and p < 0:007, respectively; post-hoc
t-test; d.f. = 78)。此外，施氮处理使固氮酶活性降低75%(p < 0:001; post-hoc t-test;
d.f. = 78),说明在土壤氮素充足时，土壤固氮受到抑制。除了这些处理效应外，固氮率间的差异也可以解释显著的变异性(p < 0.001; ANOVA; d.f. = 2)。这些响应清楚的表明，养分的限制比森林地块中土壤和凋落物化学的自然变化更强。

图1. 固氮酶-乙炔还原活性(ARA)对长期营养施肥和直接添加钼磷的响应

Nitrogenase acetylene reduction activity (ARA) in response to
long-term nutrient fertilization and direct additions of molybdenum and
phosphorus

a. 大面积森林地块长期施肥后，在O_i(凋落物)层采集的野外湿样品的ARA(n = 4
重复地块; 每个地块10个样品)；

b. ARA对从对照小区收集的土壤微域中添加Mo溶液的反应。前三个柱子代表对照(只加水)和两个不同的钼处理(n = 23/处理)。第四个柱子代表来自长期微量营养素施肥区作为对照处理的样本（只加水；n = 10）；

c. ARA对单独加水(对照;n = 15)、Mo溶液(n = 10)或三种不同浓度的分析级磷溶液(各为n=5)对土壤微域影响的反应。所有图表均显示几何平均值(±s.e.m.)，字母表示p = 0.05或更小水平处理间的统计学差异Tukey–Kramer post-hoc test)。

有关更多信息，请参见方法部分。

尽管钼和磷都被认为是固氮的潜在限制因素，但我们认识到对于我们的发现有一个简单的解释，即钼存在于长期施肥处理中。钼不仅作为微量营养素处理的一部分，而且通常作为微量污染物出现在磷肥中。除了直接检测钼的作用外，我们还评估了磷肥中微量的“非预期”钼是否能够解释长期施用+P后观察到的固氮反应。

我们以等同于田间微量营养肥料施用量大致1/2个月对1/2年(低钼对高钼)的水平施用Mo。我们使用了同一个来源的不同凋落物的混合物（对照地块的O_i层）。重复间分别接受蒸馏水中低钼和高钼处理(+42 对
+504 μg Mo kg^-1 soil 或 +0.4 对 +4.7 g Mo ha^-1) ，对照为单加入蒸馏水(0.5 kg H₂O kg^-1凋落物，相当于<0.5 mm降雨量)。为了比较短期和长期添加微量营养素的反应，在长期微量营养施肥小区，我们也仅用蒸馏水处理来自O_i层的凋落物。

这些直接添加物证实了仅添加钼就能引起由微量营养素引起的固氮酶活性的增加。(图. 1b, p < 0:03; d.f. = 2; n = 23;
ANOVA, left three bars)。固氮酶活性随着Mo浓度的增加而增高(p < 0:02; n = 79;
S = 62,578; Spearman’s rank correlation)，尽管用统计上不那么严格的事后t检验来比较低浓度Mo与对照之间的差异并不显著(p < 0.36; n = 23)。此外，高钼处理的固氮酶活性与在仅用水处理的微量营养丰富的凋落物中观察到的结果没有显著性差别(p = 0:420; n = 23,10;
t-test)。由于土壤中钼的浓度在两种处理中大致相似(微量营养素对高钼: x = 456 对
564 μg Mo g^-1 soil; s.e.m. = ±92 对 35), 我们的结论是，固氮酶活性短期对钼的反应（如在高Mo处理中测量的）与长期值(如在微量营养素地块中测定的)相差不大。这一结果支持了早前观察到的固氮酶对Mo添加的快速响应。

因为P是在比微量元素高三个数量级的用量下施用于田间的，因此我们检验了磷肥中污染的钼是否对固氮菌是一个重要的钼来源。首先，磷肥(14.1 mg Mo kg^-1; s.e.m. = ±0.8) 中钼的含量与典型的重过磷酸钙肥料一致(2.4–18.5 mg Mo kg^-1)
。其次，与对照相比，+P土壤中Mo含量显著升高(表1; 118 对 55 μg Mo kg^-1;
p < 0.001; n = 16, 8; Wilcoxon test)。第三，我们估计一年施用磷肥所产生的钼量是我们在+P处理的O_i层所测得的增加量的五倍。未解释的钼可能是由于浸出或植物吸收而丢失的。

作为对污染物Mo是否能解释长期+P施肥地块内固氮反应的最终检验，我们将未经处理的土壤置于蒸馏水溶液(对照)中，且有含有低、中、高水平 (+2.83, +28.3 和 +283 mg P kg^-1 土壤, 分别)的分析级“干净”P(未被Mo污染)或Mo(+667 μg Mo kg^-1 土壤)的处理。而添加+Mo则使固氮酶活性增加了近5倍(图. 1c;
p < 0:001; Tukey–Kramer post-hoc test),三种水平+P的添加均未引起任何高于背景值的显著响应(图. 1c; p > 0:17; Tukey–Kramer post-hoc
test)。我们得出的结论是，固氮率受钼的限制，而不受磷的限制，而且钼可能构成了一种“隐性处理”，足以在+P肥料区造成磷限制的表象。由于商品肥料被广泛用于实际生产中，以前的研究可能误解了这种明显的P效应。

结合考虑(图2)，我们的不同实验提供了一致的证据，表明单单Mo的有效性可以限制这些热带土壤中的异养固氮，并阐明了钼、氮与固氮相互作用的动力学性质。直接添加低或高水平的钼都能提高固氮酶活性(图2中的正方形和三角形)，作为长期微量营养素(菱形)和+P磷肥(圆形)(其中含一部分钼)的添加也会增加氮酶活性。相比之下，在自然中的Mo水平上长期添加氮会导致固氮酶活性受到抑制(+N)。尽管固氮的相对响应随土壤Mo富集程度的增加而增大(p <0.0001;r² =0.80;n=12)，但季节性也影响了实验的响应。例如，与在雨季(++Mo 正方形)进行的实验相比，在后期的旱季(++Mo 三角形)——环境中固氮率最低的时期，固氮酶活性的相对增加最大。

图2. 在所有养分处理中，土壤样品中相对固氮酶乙炔还原活性(ARA)是土壤Mo富集的函数

Relative nitrogenase acetylene reduction activity (ARA) in soil
samples as a function of soil Mo enrichment, across all nutrient
manipulations

圆圈代表的是在长期大面积施肥的森林地块O_i层采集到的地块区潮湿样本(n = 4 地块; 每个地块4个样品; 早期的雨季):对照组，氮(+N fert.)，过磷酸钙
(+P fert.)和微量营养素(+Micro: fert.)。数值与图1a略有不同，因为这是在所有样本的一个子集上分析土壤Mo。正方形代表的是在早期的雨季，向取自对照地块的土壤微环境中单独添加水(control)、低(+Mo)和高(++Mo) 浓度的Mo溶液(图. 1b)。菱形代表向取自长期施用微量营养素地块的土壤中添加水分(+Micro. (+H2O))。三角形代表向后期旱季的对照土壤中添加Mo溶液(++Mo)和低、中、高水平的分析级磷溶液(+CleanP)(图. 1c)。值是均值(几何体代表ARA，算术值代表Mo；±s. e. m.)。这条线表示线性回归 (p < 0:001;
r² = 0.81), 不包括+N施肥。

独立生存固氮菌的Mo限制在缺乏来自岩石养分酸性土壤的生态系统中可能广泛存在，并且Mo与铁氧化物或土壤有机质普遍络合。尽管这种情况在许多低地热带地区很常见，但在热带以外的地区，包括太平洋西北部的高度淋溶土或澳大利亚的再生农业土壤，也可以发现低的Mo含量。

至于我们的发现将如何扩展到共生固氮菌，如附生地衣(大部分与土壤环境分离)或豆科植物(依靠根和菌根真菌获取土壤矿物质)，就不那么清楚了。尽管在热带森林中，共生固氮菌从丰富到稀少分布不等，但独立生存的异养固氮菌仍然保持着地理上广泛分布的维持分子氮输入到植物-土壤系统的机制。例如，这里所研究的森林，除了在最近受到重大干扰的地区之外，在假定固氮的豆科植物中(约占基底面积的6%)其结瘤率和固氮率非常低。根据我们自己的估计，排除最近的干扰，异养固氮似乎是向这些原生林持续输入氮的一个重要载体虽然缺乏直接的措施，但在整个热带森林内，共生固氮率和 自生固氮率可能各不相同，因此对固氮的控制是一个真正关键的问题。

我们在此首次表明，在生长于风化酸性土壤上的低地热带森林中，微量元素Mo可单独在非共生固氮中发挥核心作用。这些发现表明，我们对热带固氮的一般观点应该被拓宽，其超越了传统的强调以大量营养素P和氮作为主变量的观点。此外，由于大多数耦合的碳气候模型预测即随着森林对二氧化碳施肥的反应，氮需求将大幅增加。钼可能是目前或将来对至少一些为提供植物生长所需额外氮的固氮菌能力的潜在限制。更广泛地说，我们的发现对微量金属在陆地生态系统中潜在的但很大程度上未被探索的作用提出了新的问题。虽然我们直到最近才认识到铁对世界海洋中固氮限制的明显重要性，然而我们对陆地生态系统中微量金属的了解就更少了。

方法

Methods

研究地点

Study site

加甘特施肥试验地位于位于巴拿马科罗拉多州巴罗加甘特半岛上自然保护区的一个具有多样性植物(300多种)的原始森林。年平均降水量2600毫米。自1998年开始在5月到12月雨季期间，每年进行4次该试验，其包括36块40×40米的土地，包含九种施肥处理(对照、因子设计中的N/P/K或微量营养素)。本文中用于试验的处理为N(尿素，125 kg N ha^-1 yr^-1)、P(重过磷酸钙50 kg P ha^-1 yr^-1)和微量营养素(标准微量元素混合物  25 kg ha^-1 yr^-1, 包括 Mo  0.01 kg ha^-1 yr^-1, 以及 S,
Cu, B, Fe, Mn , Zn 及 CaMg(CO₃)₂)。

固氮作用

Nitrogen fixation

我们从随机分布的100平方厘米区域收集了野外潮湿的O_i层凋落物。水分含量在各处理间无差异(p > 0.53, Kruskal–Wallis, d.f. = 3, n = 95)。样品被放置在干净的480毫升玻璃瓶中，装上丁基橡胶隔片，在室外室温下培养。10%的顶空被C₂H₂取代。混合的顶空样本分别于5小时和10小时采集，储存在气密瓶中，并于48小时内在配备火焰离子化检测器和Poropak N柱的气相色谱仪上测定C₂H₄。干燥并储存样品进行水分含量和营养元素分析。试验表明，在光照和黑暗条件下固氮酶-乙炔还原活性(ARA)没有差异，在没有C₂H₂的情况下乙烯产量也没有差异。我们在4个处理的16个施肥小区共进行了160个ARA培养实验(2003年12月(后期的雨季，n = 2 样本/地块)，2004年7月和11月(前期和后期的雨季，n = 4))。在进行统计学分析之前，对固氮率进行对数变换，并将与0相近得难以区分的固氮率赋于0.05 nmol g ^-1 h ^-1的最佳情况考虑的检出限。我们使用方差分析来对比不同营养处理间的差异，包括第二期，其捕获了个体样本之间季节性的差异。我们通过将凋落物细分为3个重复进而计算了C₂H₄  ：N2的转化率：2个在C₂H₄中, 1个在含 59 % ¹⁵N₂空气中。用同位素比质谱分析测定了¹⁵N的组成;加入标准的样品相对于参考样品有显著的富集 (paired Wilcoxon test, p < 0.0001, n = 18)，几何平均转化率为7.9 (n = 18, 95% 置信区间:
3.1–20.3)。这个比率是假设24小时固氮时用来提供一个固氮情况的估计，凋落物密度为950 g m^-2。我们对固氮的估计可能是保守的，因为研究通常使用的转化率是这个值的一半(3.9) 。

钼和磷的添加

Mo and P Additions

2005年7月，我们从未经处理的对照林的12个随机地点和加微量营养的长期施肥点收集了O_i层的样本。我们使用喷雾瓶对40克对照的凋落物样品(湿重)进行三种处理(n = 23 /处理):加14ml蒸馏水(对照)，或+42与+504μg Mo kg^-1 (如 Na₂MoO₄) 到 14 ml水中(低Mo与高Mo)。另外，对于从微量营养素区采集的样品也用14毫升蒸馏水处理(n=10)。在开始ARA测定前，我们让样品在现场条件下平衡12小时(如上所述)。在2008年5月(后期旱季)，我们从对照地块收集了O_i层的样本。按照上述ARA测定的培养方法，我们采用了五种处理方法：+14 ml 蒸馏水(对照;n = 15),+667 μg Mo kg^-1 （如 Na₂MoO₄） 到 14 ml 水中 (+Mo; n = 10), +2.83, +28.3, 与 +283 mg P kg^-1 如 NaH₂PO₄ 到 14 ml 水中(+low P,+medium P and +high P, n = 5, respectively)。

土壤养分

Soil nutrients

样品被磨碎，在浓硝酸中消化，用于钼(2 μg Mo kg^-1 检出限)和磷(60 mg P kg^-1 检出限)的分析。利用红外气体分析燃烧法对各自磨碎的样品进行了碳氮分析。

编译读后感

透过现象看本质，作者经过全面而精心的实验设计深刻剖析了以前的研究对这种明显的P效应的误解的原因，从而拨开迷雾揪根寻底推翻前人对P是限制固氮率这一结论的误解，确立了Mo才是限制固氮率的这一真理，实验设计巧妙，思考全面，论据充分，论证有力，结果令人信服。

编译疑问

1.为什么固氮几乎只发生在土壤有机质含量最高的凋落物层即O_i层，是否C/N比是影响固氮更关键的因素；

2.为什么雨季相较于旱季固氮活性高，固氮是否与土壤水分含量相关。图1a与图1b中微量元素处理的固氮活性是否因为水分的原因导致差别那么大，而图1a与图1c的对照处理差异不大，难道水分的影响是在养分的基础上才发挥作用的。

写在后面

由于之前本人编译工作重大失误导致了这种题目编译错误的令人啼笑皆非的囧境，实在抱歉！多多包涵！欢迎关注《宏基因组》公众号，我会更加严谨更加努力为大家呈上更优秀的作品

编译简介：南京农业大学博士在读，单身科研狗，欢迎骚扰！

编译：马腾飞 南京农业大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

Alexander R. Barron, Nina Wurzburger, Jean Phillipe Bellenger, S. Joseph Wright, Anne M. L. Kraepiel and Lars O. Hedin. Molybdenum limitation of asymbiotic nitrogen fixation in tropical forest soils. Nature Geoscience volume  2, pages 42–45(2009) doi:10.1038/s41586-019-1734-x

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