自然界的循环利用：厌氧微生物群落推动着自然生物质的降解

Nature’s recyclers: anaerobic microbial communities drive crude biomass deconstruction

Current Opinion in Biotechnology

Impact Factor 8.803 | CiteScore 8.45

https://doi.org/10.1016/j.copbio.2019.08.015

发表日期：2020-04-01

第一作者：Stephen P Lillington¹

通讯作者：Michelle A O’Malley¹

合作作者：Patrick A Leggieri, Kellie A Heom

主要单位：

¹ 美国，加州大学，圣塔芭芭拉分校，化学工程系（Department of Chemical Engineering, University of California, Santa
Barbara, CA 93106, United States）

摘要

地球上厌氧生态系统中的微生物群落涉及到碳的降解与碳循环，大量的菌株从厌氧的微生物群落中被筛选出来，由于其含有丰富的碳水化合物活性酶（CAZymes）因此能将木质纤维素分解成易降解糖。然而，天然厌氧菌群落拥有丰富的微生物多样性，这些多样性还有待生物技术应用来将粗生物质水解成糖和增值产品。这篇综述重点介绍了厌氧微生物基因组序列的“组学”技术的最新进展，解释厌氧微生物群落的微生物组成，并对厌氧微生物群落所包含的碳水化合物活性酶的多样性进行表征。我们以食草动物瘤胃为重点，进一步讨论了发现新的碳水化合物活性酶（包括那些在多酶真菌纤维素中发现的）的方法。本文综述了近年来用来描述有关厌氧菌间相互交织的新陈代谢和空间的相互作用的新兴的技术。这对于促进对厌氧菌群落的预测性认知从而指导微生物工程至关重要。

前言 Introduction

将有机废物转化为可持续利用的增值产品是全球的迫切需要。自然条件下，有机碳的降解与循环很大程度受到厌氧微生物的调节，它们共同作用分工明确地完成困难的生物催化水解步骤。工业生产从大量的厌氧菌株受益良多，很多厌氧菌株被筛选出来，甚至代谢工程被应用于生物技术。例如，在陆地生态系统中，源自于瘤胃的微生物群落在从植物中分解糖的方面是高效的，并提供了大量工业来源的酶用于从植物废物中分解碳水化合物。甚至是缺氧的海区和沉积物也已经提供了关键菌株和酶机制来帮助碳和氮的循环利用。通过利用这些微生物的厌氧消化作用，可以进一步加速废弃物降解成沼气、中链脂肪酸、甚至可以通过与模式微生物的合作从而加速代谢工程产物的生成。

虽然从厌氧生态系统中已经鉴定出很多微生物菌株，但是它们都不能以维持生物能源和可持续的化学市场所需的高转化率来降解木质纤维素。木质纤维素生物质的生物加工受到酶和转化的限制，这需要大量的预处理和分离步骤来去除木质素并将碳水化合物聚合物分别水解成可降解的糖。通常，许多水解副产品对微生物个体是有毒的。因此，降解木质纤维素的途径通过设计化学方法对生物量进行定量，这将导致一系列的异构产品。因此，采用动态厌氧群落中常见的分解策略是很有吸引力的，在动态厌氧群落中，微生物已经进化到产生互补的几组木质纤维素降解酶，这些酶在微生物之间分配分解产物和代谢物，并减轻对群落的整体毒性。

微生物富集，测序和生物信息学方法的出现为破译厌氧微生物群落中的功能并将其用于生物能源和可持续的化学产品提供了新的机会。关键在于尽量减少——或完全消除——与预处理相关的工作，并降低所需的酶负荷。这篇综述介绍了厌氧微生物群落的组成以及它们通过新兴的“组学”技术而获得的酶学策略。我们进一步讨论了目前对厌氧菌动态代谢功能的理解及它们相互交织的代谢，并展望了利用厌氧菌群进行木质纤维素生物转化的新策略。

“组学”工具揭示了厌氧微生物群落的多样性

‘Omics’-tools reveal the microbial diversity
within anaerobic communities

绝大多数厌氧微生物的研究都描述了细菌的种类和功能，但重要的是要认识到，复杂的厌氧微生物群落通常以真菌、古生菌、原生生物以及大量的病毒和噬菌体为特征。虽然与细菌相比，这些类群的丰度较低，但它们对能改变碳流动以及关键发酵产物生成的微生物群落起着重要的功能。在瘤胃系统中，厌氧细菌(如梭菌、瘤胃球菌科)是著名的纤维素降解菌，并产生广泛的糖基水解酶(GHs)和多种纤维素团，将纤维素解聚成纤维二糖，并运输到细菌细胞。近年来，厌氧真菌(新丽鞭毛菌门)得到了广泛的分离和测序，被发现含有丰富的碳水化合物活性酶(CAZymes)和真菌纤维素体，它们通过真菌的根状菌丝来分解纤维状生物量。虽然古菌产甲烷菌不直接参与生物质的降解作用，但它与厌氧细菌和真菌都有密切的联系，主要将释放出的H~2~、醋酸盐、 甲酸盐同化成甲烷，为生物质的解聚提供了良好的条件。

此外，在厌氧微生物群落中已经发现了原生生物和一系列的病毒和噬菌体，这些神秘的、几乎未被探索的功能可能调节微生物种群，物种进化，甚至甲烷的产生。

近年来在高通量测序、生物信息学工具和综合多组学技术方面的进展，阐明了厌氧微生物群落的分子细节，这扩展了我们对厌氧菌株及其在群落中的作用的认识(图1)。在政府机构如能源部(DOE)的支持下，联合基因组研究所(JGI) IMG数据库目前正在填充细菌、古生菌和真核生物的7万个基因组。联合基因组研究所拥有1300个真菌基因组，其中包括6个来自厌氧真菌的基因组草图和转录组。这些基因组已经用生物信息学工具如BLAST和隐马尔科夫模型通过使用序列同源性来推断功能从而进行了预测的功能注释。同时增加序列数据库的容量和多样性(如GenBank、PFam、UniProt和InterPro)只会继续提高对基因组注释的可信度，并为厌氧微生物基因组提供新的见解。令人惊讶的是，在厌氧真菌基因组中高度保守基因的启动子附近发现了大量的6-甲基腺嘌呤，表明这与基因表达有关。对厌氧真核生物中表观遗传学和DNA甲基化作用的持续研究是非常必要的，他可以帮助破译描述不清楚的基因组区域和推测的蛋白质功能。

图1. 多重组学分析阐明了微生物群落是如何相互协作以发挥非凡功能的

宏基因组数据集在一个群落中建立基因组和基因集，而宏转录组实验验证了活跃表达的基因。蛋白质组学和代谢组学为基因和通路活动提供了实验验证，并可与通量组学分析相结合，将这些“组学”数据集与动力学模型联系起来。总之，这个“组学”流程加速了基因发现和调控模式，并为破译微生物群落水平的相互作用提供了线索。

基因组数据库的增长也是大量宏基因组组装的结果，其动机是需要对厌氧微生物群落（如瘤胃、垃圾填埋场和消化道微生物群落）中存在的生物和酶进行分类。这些研究对从环境样本中提取的微生物DNA进行排序，并计算将宏基因组序列读长组装成支架(scaffolds)，然后筛选感兴趣的基因，如CAZymes（碳水化合物活性酶）。有了足够的测序深度，测序读长可以被拼接和分箱以获得未培养生物的基因组草图。早期的宏基因组组装来自于奶牛瘤胃组装的未培养微生物的１５个宏基因组组装的基因组，其完整性大于６０％。随着生物信息处理和测序成本的提高，最近的研究已经成功地将数千个以前未被发现的与与公共数据库中的序列不匹配的（碳水化合物活性酶）CAZymes组装了近1000个MAGs（宏基因组装配的基因组）。详见《NBT：牛瘤胃微生物组的参考基因组集》。

许多MAGs由于高度碎片化、嵌合或含有污染的测序读长而导致质量相对较差，因此这种特性通常仅限于DNA指纹。尽管如此，一些MAGs已经通过培养分离菌得到了改进并且Hungate1000项目组装了400个物种基因组草图，几乎所有可用的分离都在这个综述中。尽管如此，只有不到１％的细菌是可培养的，这种采样偏差的一个可能的解决方案是利用单细胞测序。与宏基因组学一样，单细胞测序绕过了培养，但可解决菌株内的基因组异质性，并可针对数量较少的物种。然而，单细胞扩增基因组（SAGs）存在扩增偏倚及完整性低的问题，与参考MAGs比对是组装的最佳方法。宏基因组之外的方法参考《mSystems：鸟枪法宏基因组测序之外我们还能做什么》。

厌氧群落的宏组学已发现大量碳水化合物活性酶CAZymes

Meta-omics of anaerobic communities has identified a wealth of CAZymes

大量的宏组学研究表明，厌氧生物降解群落中存在大量CAZymes(Table 1)，CAZymes被定义为合成、降解或结合糖类的酶，可分为六个不同的种类－糖苷水解酶(GH)，糖基转移酶(GT)，多糖裂解酶(PL)，碳水化合物酯酶（CE），碳水化合物结合模块(CBM)以及辅助活性(AA)其包括木质素水解活性酶和水解多糖单氧化酶。这些类包含大量的科和亚科，反映了这些酶的活性和特异性的巨大多样性。CAZymes权威的数据库CAZy的从2013年的34万个蛋白质条目膨胀到现今超过140万，大大超过了实验表征CAZymes的数量上的增长速度。

宏基因组学与宏转录组学已经促进了这种序列信息的巨大增长，但是应该注意的是这些分析仅反映了基因组的潜能和在测序样本中表达的基因，并不一定反映活性蛋白的产生。迄今为止，对生物降解微生物群落的宏蛋白质组学分析仅报导了数十份CAZymes的阳性序列(表 1) 反映了在使用质谱蛋白质组学对复杂样品中的蛋白质进行可靠鉴定的挑战。此外，使用组学方法对基因、转录或蛋白质功能进行基于同源性的注释仍然是假定的，并且需要大量的实验表征使功能与序列的对照更可信。这种方法的成功最近在ＣＡＺｙ数据库对５００多个CAZymes的生化特性描述中进行了验证，这导致了新的CAZyme科的发现并将功能分配给25个以前被分类的亚科。

表1. 代谢组学数据调查显示不同厌氧微生物群落中存在的碳水化合物活性酶（CAZymes）的数量和类别

CAZymes在厌氧生物降解菌群联合体的具体成员中分布极不均匀。例如，在驼鹿瘤胃中分解木质纤维素的菌群联合体，形成一个由聚合物降解物和糖发酵剂组成的专门的代谢网络，它们协同有效地分解植物碳。在这些群落中，大量的CAZymes生产者采用不同的策略来增强他们降解生物质的能力。大多数的有氧纤维素分解真菌和细菌分泌自由酶，而许多的厌氧细菌真菌产生大量的称为纤维素体的复合物。据推测，厌氧发酵的低能特性推动了纤维素体的进化从而作为一种提高纤维素水解效率和产品摄取的策略，但其进化的本质以及他们在有氧环境下的异常仍然是不清楚的。到目前为止，只有少数的生物体能够产生具有多种催化结构域的CAZymes，但极有可能在厌氧木质纤维素分解菌群中发现许多其它有趣的纤维素酶。

真菌的纤维素体表现出令人印象深刻的纤维素水解活性

Fungal cellulosomes exhibit impressive cellulolytic activity

纤维素体是厌氧微生物体内的多蛋白的复合物，他可以协同定位催化酶以增强纤维素的分解活性。在厌氧细菌和真菌系统中，酶的N和/或C末端的锚定(dockerin)结构域通过与中心支架蛋白上的内聚蛋白重复结构域的相互作用调节复合物的形成。尽管细菌纤维素早已为人们所熟知，但是关于真菌纤维素体装配背后的组成部分和其机制的细节直到最近才被发现。细菌和真菌的纤维素系统成分不具有序列相似性，它们的结合特异性和亲和性存在明显差异。尽管细菌和真菌的纤维素组分序列是不同的，但厌氧真菌中有几种含有dockerin的蛋白质，它们的催化结构域与细菌酶密切相关，表明瘤胃真菌、细菌间普遍存在水平基因转移事件。

在两种纤维素系统中，在含有dockerin域的蛋白中，CAZymes占绝大多数，但也发现了许多其他类型的蛋白质，包括孢子衣蛋白、酶蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂。事实证明，纤维素体比游离酶更能增强纤维素的分解活性，且前者是后者的１２倍，并且细菌的dockerin黏连蛋白系统已经被用作合成生物学工具，用于增强许多不同的反应途径。由嵌合物CAZyme -dockerin和支架蛋白组成的久负盛名的纤维素体在协同细菌酶的纤维素水解活性方面已经取得了很大的成功，而结合来自不同生物的CAZymes在一起来优化酶制剂的热稳定性和活性广度的前景，为解决生物加工过程中的生物量降解瓶颈提供了一条有吸引力的途径。

转录组学揭示了微生物的协同作用和酶的调节

Microbial cooperation and enzyme regulation are revealed by transcriptomics

联合培养厌氧木质纤维素微生物是解决生物质降解瓶颈的另一种有吸引力的途径，因为它‘分解并克服’许多个微生物之间进行分解和转化的困难步骤。简单的共培养方法涉及两种生物，如真菌－甲烷菌共培养，作为可处理的模型系统，以补充宏组学研究从而阐明微生物间的合作(图1)。最近的一项研究表明，当厌氧真菌与甲烷菌共培养时，CAZyme活性与基因表达显示出代谢的显著增加。基于互补代谢，交换发酵产物，或者由于生物质水解，培养基中的发酵糖过量，这些策略可以建立在联合培养中束缚外源性微生物上。

转录组学方法也提供了一种基于其与特征转录本之间的协同调节用来识别厌氧生物中假定的、不带注释的酶的方法。例如，来自厌氧真菌Piromyces finnis的RNA-Seq数据产生了大量未鉴定的酶，这些酶在糖代谢物的抑制下其与CAZymes共同被抑制。该方法的扩展验证了类似的分解代谢物在真菌N. californiae 和A. robustus中被抑制的行为，揭示了其中一些共同调节的转录本是真菌纤维素体的组成部分。另一种方法是，表征未知的酶在具有特定的装饰或相似连锁模式的特定多糖存在时上调，揭示了协同调控与给定底物相匹配的CAZymes酶活性。　　

除了基因组分析外，未来的单细胞转录组方法的发展有望在个别的厌氧菌以及在共同培养与联合系统中捕获基因表达的异质性。原核单细胞RNA-Seq由于RNA丰度低及缺乏聚腺苷酸ｍＲＮＡ，在哺乳动物单细胞技术方面的进展相对滞后。亚微克或纳克量的RNA的扩增已通过PCR(Smart-seq2和SUPeR-seq ）或链置换等方法完成，但是这些方法的灵敏度较低。低的检测效率（通常＜１０％）难以对原核生物进行测序；大肠杆菌的平均转录拷贝数是小于１０／细胞。此外这些方法没有一个广泛地适用于原核生物，它们通常依赖于寡聚胸苷酸引物，跳过ｒRNA的消耗（接受基因芯片而不是二代测序）或者利用菌株特异性ｒＲＮＡ　的消耗。原核系统中单细胞RNA-seq技术的成熟将开启我们对微生物群落中微生物基因的表达和代谢功能更深入的理解。

基因组级代谢模型存在于一组有限的厌氧菌中　　

Genome-scale metabolic models exist for a limited set of anaerobes

微生物基因组的系统的分析通过基因组规模模型（GSMs）的发展有利于我们更好的理解其代谢机制。GSM是细胞内代谢通路的系统级代表，它们的组成底物、产物、酶以及基因编码了这些酶。通过通量平衡分析（FBA），生物约束可以被耦合到一个源于GSM的数学模型中从而产生对生物体稳态代谢通量分布的预测。这种方法经常指导代谢工程的工作，并可以扩展到共同培养的几个物种。此外，FBA框架还可以用于预测生物信息学（in silico）中微生物体系的稳定性，并可推广应用于消化系统中基质活性的预测，如进料不同的厌氧消化系统，或设计用于牲畜的特定饮食的益生菌。

目前可用的GSMs捕获了厌氧细菌和产甲烷菌的广泛代谢。厌氧细菌在瘤胃微生物群中起着多种作用，GSMs已经被开发用于几种梭状芽孢杆菌，它们专门从事纤维素降解、生成醋酸和酒精。产甲烷菌的代谢也具有很好的特征，并被广泛的模拟。最近的两篇综述讲解了近年来产甲烷菌基因组规模模型的现状、遗传关系和基因工程的研究进展。

参见Feist等人实验验证的GSMs的活跃更新的列表，Senger等人对几种GSMs中的厌氧细菌、产甲烷菌和酵母及其生物技术应用方面进行了综述。

到目前为止，还没有厌氧真菌的GSMs的存在，且它们的发展受到了一些挑战的阻碍。厌氧真菌基因组最近才被鉴定出来且高质量的基因组很少。这些物种中生长在单一糖类且通过底物限制和代谢通量分析实验促进GSM管理的自定义培养基中的物种数就更少了。基因敲除对模型验证很有用，但厌氧真菌的基因工程工具仍在开发中。尤其令人感兴趣的是肠道真菌的氢化酶体代谢的阐明，这对ATP的产生有重要的影响，但至今仍未解决。我们对厌氧真菌中氢化小体机制的理解将受益于高质量的基因组，并对模拟肠道真菌和产甲烷菌之间的自然共生关系至关重要。

厌氧生物群落的代谢和空间相互作用可通过生物信息学进行模拟

Metabolic and spatial interactions in anaerobic consortia can be modeled in silico

厌氧微生物群落的模型可以在一系列的尺度上进行发展，从基于细胞级的建模发展到过程级建模，并可以重建微妙的代谢相互作用和空间组织。木质纤维素厌氧降解菌群通常形成非均质生物膜，其中物种和环境之间的几何结构和质量运输对新陈代谢有显著的影响。在由好氧真菌生物膜与浮游厌氧产甲烷菌和细菌相互联系组成的批处理系统中有很少的实验研究用来描述木质纤维素的活性。在这些系统中，局部浓度梯度非常明显以至于专性厌氧与好氧生物膜可以共存于一个反应器中，这突出了在联合模型中考虑大规模转运的价值。

包括肠道真菌在内的厌氧菌群几乎总是局限于分批培养，因此FBA必须扩张到非稳态行为的模型。动态FBA（dFBA）已成功地应用于两种梭菌共培养的纤维素代谢模型，梭菌/沃廉菌共培养体系中的葡萄糖代谢, 用生物信息学预测稳定的合成生物降解菌群，以及由Henson等人概述的基于其他微生物群落的应用。除了混合好的不稳定的系统外，还有几个模型（表2）整合了基因组尺度的代谢和时空的大规模转运。虽然这些研究没有明确模拟生物量退化，但是一但我们了解了真菌生物膜的结构，空间的dFBA(sdFBA)的建模原理能被扩展到包括厌氧真菌在内的木质纤维素降解菌群（consortia）。

表2. 专性和兼性厌氧菌的基因组规模代谢模型结合时空物质转运

结论与展望

Conclusions and perspectives

近年来，通过多组学技术的应用，厌氧微生物群落在实现生物技术潜力方面取得了巨大的进步。编码CAZyme序列的数据量极速增长，特别是由最近的多组学工作产生的非字符化序列说明了这些技术在阐明复杂系统内容方面的威力。通过生物化学或靶向表达实验对这些序列进行细致的描述，无疑将为CAZyme群落带来具有非凡功能的新颖的酶，不仅扩展了用于生物处理酶的工具箱，而且改善了为准确的GSMs提供的基因组注释。然而，要完全了解微生物群落是如何合作降解生物质，需要我们对异质生物膜中发生的代谢和空间相互作用的理解方面取得重大进展，需要能够表征生物空间分布特征和解决物种特异性生长速率的生物成像技术。尽管如此，在组学和代谢表征技术方面的未来进展可能使我们对厌氧微生物群落的预测理解成为可能，从而使微生物群落成员和菌落生产的复杂工程成为可能。

编译：马腾飞 南京农业大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

Stephen P. Lillington, Patrick A. Leggieri, Kellie A. Heom & Michelle A. O’Malley. Nature’s recyclers: anaerobic microbial communities drive crude biomass deconstruction. Current Opinion in Biotechnology 62, 38-47, doi:https://doi.org/10.1016/j.copbio.2019.08.015 (2020).

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