野生哺乳动物的皮肤和肠道微生物群对环境污染做出的反应

Skin and gut microbiomes of a wild mammal respond to different environmental cues

译者：葛德燕 中科院动物所

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

Microbiome, [9.133]

https://doi.org/10.1186/s40168-018-0595-0

Published:  26 November 2018

第一作者：Anton Lavrinienko¹

通讯作者：Anton Lavrinienko¹ anton.lavrinienko@oulu.fi

合作作者： Eugene Tukalenko^1,2, Tapio Mappes3 and Phillip C. Watts^1,3

主要完成单位

1 芬兰奥卢大学生态与遗传学系 （Department of Ecology and Genetics, University of Oulu, Finland）

2 乌克兰塔拉斯舍甫琴科国立
基辅大学，生物与医学研究所（Institute of Biology and Medicine, Taras Shevchenko National University of Kyiv, Ukraine）

3 芬兰于韦斯屈莱大学 生物与环境科学系 （Department of Biological and
Environmental Science, University of Jyväskylä，Finland）

划重点

核辐射污染是人类健康面临的巨大威胁之一，然而，怎么量化这种污染对生物有机体的影响呢？今天推荐阅读的这篇文章给我们树立了非常好的研究案例。文章作者通过研究乌克兰切尔诺贝利核电站4号机组反应堆爆炸留下的核禁区对堤岸田鼠皮肤和肠道微生物群产生的影响，发现核污染可能会使受污染影响的栖息地微生物群落趋于均匀。相关研究成果分为两篇论文分别以这种田鼠的皮毛菌群和肠道菌群为讨论重点。此篇重点讨论皮毛菌群。关于肠道菌群的研究请见Lavrinienko et al 2018. Environmental radiation alters the gut microbiome of the bank vole Myodes glareolus. The ISME Journal. 2018;12:2801–2806.

热心肠日报

辐射及地理位置对田鼠皮肤及肠道菌群的影响

创作：沈志勋 审核：沈志勋 2018年12月04日

原标题：野生哺乳动物的皮肤及肠道菌群对不同环境因素的应答

1. 对切尔诺贝利隔离区（CEZ）之内及之外的堤岸田鼠的皮肤及肠道菌群进行分析对比；

2. 雄性田鼠的皮肤菌群多样性高于雌性田鼠，而CEZ内部的田鼠的皮肤菌群α多样性更高；

3. 相比于CEZ外部的田鼠，CEZ内部的田鼠的皮肤菌群群落表现出更高的相似度，而地理区域对田鼠皮肤菌群的影响大于辐射；

4. 与皮肤菌群不同，田鼠的肠道菌群群落结构与接受辐射的水平显著相关，且辐射的影响大于地理区域。

主编评语：Microbiome上发表的一项最新研究，对比了切尔诺贝利隔离区内外的河堤田鼠的皮肤及肠道菌群，发现皮肤菌群更多地受到地理区域的影响，而核辐射更多地影响了肠道菌群。

摘要

背景

Background

动物皮肤和肠道微生物群落是宿主健康的重要组成部分。然而，对形成野生动物微生物群落的过程知之甚少，特别是在接触环境污染物方面。研究者使用16S rRNA扩增子测序来量化暴露于放射性核素对一种小型哺乳动物——堤岸田鼠（bank vole）的皮肤和肠道微生物群的影响。Myodes glareolus， 这种田鼠群居在乌克兰切尔诺贝利禁区 （Chernobyl Exclusion Zone， CEZ）内外。

（此图片来源于网络）链接：http://img3.cache.netease.com/photo/0009/2017-04-26/CIUU2IDC724Q0009.jpg

译者注：1986年4月26日，乌克兰切尔诺贝利核电站4号机组反应堆爆炸，数百万人受辐射影响，酿成迄今为止世界最严重的核泄漏事故。

结果

Results

雄性堤岸田鼠的皮肤微生物群落多样性高于雌性。然而，皮肤微生物群更大的差异发生在更大的空间尺度上，在CEZ区域内，不管是否受到放射性核污染，堤岸田鼠的皮肤微生物群落与CEZ外未受污染的区域相比具有较高的alpha多样性。同样，不管受到核污染的程度如何，皮肤微生物群落(beta多样性)在CEZ内表现出比在基辅附近区域更大的相似性。因此，与土壤放射性核素水平相比，这种田鼠皮肤微生物群落的结构更多地受地理因素的影响。这一模式与这种田鼠肠道微生物群组成形成了鲜明对比，在这些地方，微生物群落在距离较远(约80公里)、未受污染的地方可能惊人地相似，而且微生物群落结构的差异与放射性水平有关。我们还发现，同一个体的皮肤和肠道微生物群落的相似与否取决于暴露于放射性核素的潜在风险。

结论

Conclusions

堤岸田鼠的皮肤和肠道微生物群落对相似的环境信号有不同的反应，因此在不同的空间尺度上有不同的结构特征。我们的研究表明暴露于环境污染如何影响哺乳动物宿主的皮肤和肠道微生物群落之间的关系，可能会使受污染影响的栖息地的微生物群落趋于均匀。

关键词

Keywords

人为影响，生物多样性，电离辐射，污染，皮肤微生物群，野生哺乳动物

前言

Background

动物皮肤(skin, SK)和胃肠道(gastrointestinal tracts, GI)承载着多种微生物群落(microbiomes)，它们对宿主的健康非常重要。SK和GI微生物群落的组成可以通过以下作用影响宿主的健康:(1)形成屏障，防止病原体的入侵;(2)帮助训练免疫系统;(3)调控炎症；而GI微生物群还能(4)通过发酵提供能量和其他重要的代谢物，否则难以完成消化食物的任务。因此，了解引起微生物群落组成变化的过程，以及个体在特定环境下微生物群落表现出的共存尺度（concomitant scale）是很重要的。

人类SK菌群的组成可能受到地理位置、特定生境暴露、个体和体位（body site）、宿主年龄和性别等因素的影响。动物SK菌群的研究较少，但地理、环境、身体部位，以及圈养状态决定了动物SK菌群的数量和组成。GI微生物群落还受地理、寄主年龄和环境等因素的影响，但寄主饮食在塑造人类和动物的微生物群落方面具有明显的作用。

尽管许多研究报告了SK和GI微生物群落对宿主健康的重要作用，但这些群落通常是相互独立进行研究的。因此，个体宿主的SK和GI微生物群落之间的潜在关系尚未(或缺乏)在野生动物(或确实在家养、实验室动物或人类)中建立。由于个体的微生物群落来自于环境，因此宿主上不同微生物群落之间存在一定程度的相似性。然而，SK和GI微生物群落的最终组成至少反映了它们在各自不同生态位中的选择。例如，皮肤是干燥和需氧的，营养成分稀少，pH值、紫外线照射、温度和皮脂含量各不相同。而结肠是潮湿和厌氧的，温度稳定，富含宿主食物的营养。因此，健康个体的SK和GI微生物群落可能是不同的。由于对来自同一个体的GI和SK微生物群进行明确比较的情况很少，因此这些微生物群是否会在相同的空间尺度上对相似的环境诱因做出反应，这在很大程度上是未知的。鉴于皮肤及其微生物群与环境直接接触，可以预测SK微生物群的变化反映了环境的多样性。相比之下,GI微生物群受宿主饮食的强烈影响，其与更广阔的环境之间的关系并不总是直接的。

考虑到人类对环境的广泛影响，可以想象SK和GI微生物群落都是由人类活动的类型决定的。例如，暴露于各种化学物质、重金属或电离辐射可改变实验鼠的胃肠道微生物群。大多数环境污染物对SK菌群的影响尚不清楚，但预计会改变SK菌群的多样性和组成。然而，令人惊讶的是，很少有研究量化了人为栖息地的改变如何影响野生动物的微生物群落组成。据我们所知，在实验室或野生哺乳动物中暴露于环境污染物对SK菌群的影响尚未得到研究。

放射性核污染是人类和野生动物遗传毒性（genotoxicity）的潜在来源，人类活动导致放射性核素释放到环境中，在世界各地留下许多长期受污染的地区。值得注意的是，1986年切尔诺贝利核电站Chernobyl Nuclear Power Plant， CNPP） 4号反应堆发生爆炸，在乌克兰、白俄罗斯、俄罗斯和欧洲部分地区释放了大量的放射性核素。CNPP周围的放射性核素，如锶-90(^-90S)、铯-137 (¹³⁷Cs)和钚-239 (²³⁹Pu)水平持续升高，而邻近区域(半径约30公里)以切尔诺贝利禁区的形式限制了人类进入(CEZ)。居住在CEZ的野生动物为研究暴露于环境核辐射污染的生物提供了最好的研究模型。

CEZ内的环境受到持续的放射性核素污染的影响，长期暴露于由这些污染物产生的电离辐射中。这些污染物对生物体有不同的影响，例如对无脊椎动物群的丰度和多样性、鸟类群落和哺乳动物的密度均产生了负面影响。相反，有证据表明，暴露于高水平的放射性核素对大型动物的密度几乎没有影响。同样，对微生物群落组成的研究也得到了相互矛盾的结果，即在辐射对群落多样性和丰度的影响方面结论不一致。例如，研究者们对定居于CEZ污染地区的自由生活微生物的多样性与未污染区域相比得出明显减少、相似或更多样化，各自不同的结论。来自受污染区域的鸟类羽毛细菌群落与未污染区域相比有降低的趋势(2.9μSv / h)。在小型哺乳动物中，暴露于CEZ内的环境放射性核素改变了GI微生物群的组成，但没有改变群落的多样性(堤岸田鼠)。目前还没有一项研究量化暴露于环境放射性核素对野生哺乳动物SK微生物群的影响。

此项研究的目的是(1)量化环境辐射对一种小型哺乳动物SK微生物群(bank vole, Myodes glareolus)的影响，并(2)直接比较SK和GI微生物群适应环境的变化。为了实现这些目标，我们分析了从CEZ内和CEZ外的放射性污染区以及控制区(放射性核素水平没有升高)内收集的动物皮毛拭子和粪便样本。我们预测堤岸田鼠SK菌群对辐射暴露很敏感，类似于GI菌群的效应，SK菌群在更大的空间尺度上有所不同，反映了环境的变化。我们也期望相同个体的SK和GI的微生物群落高度不同，这与它们不同的生态位相一致。

方法

Methods

堤岸田鼠诱捕与研究设计

Bank vole trapping and study design

堤岸田鼠用于研究野外暴露于放射性核素的影响是一种理想的哺乳动物模型。主要原因有以下几点：

1. 这一物种在CEZ内部和外部都很常见，
2. 堤岸田鼠吃受污染的食物，生活在土壤表面和内部，在那里它们会经历相当强的污染(即> 10 mGy/d)吸收辐射剂量;
3. 作为一种小型啮齿动物，它的家域范围相对较小(0.7-0.8 ha)，扩散能力有限，在繁殖季节最高可达1公里)，因此这些动物的外部辐射暴露反映了它们捕获地点的环境辐射剂量。后一点很重要，因为CEZ内的放射性核素污染是镶嵌在一起的，受污染和相对未受污染的地区可相隔约1.5公里。

2016年5月25日至6月19日期间，在乌克兰北部的70个捕鼠点捕获了田鼠。 每个地方都有16个Ugglan 2号专用陷阱(Grahnab, Sweden)置于4×4的网格中，陷阱间距离为20 m。每一个地点的诱捕期为连续三个晚上。 在下午晚些时候设置陷阱，第二天一早收集动物。用盖格-穆勒剂量计(Geiger–Mueller dosimeter)在离地面1厘米的地方测量了所有捕获点的土壤辐射水平。

采样点设置在三个区域，CH, CL 和KL， 以对比分离的空间环境中核辐射水平不同对动物造成的影响(图1)。 在这三个取样区，又分别设计了2-3个重复取样地(CH1, 2，3, CL1, 2 和 KL1, 2)，以控制除了核辐射水平不同之外的其它环境因子，如：栖息地的差异。三个研究领域因此代表两种放射性核素污染不同的环境: 1)高(CH1,均值= 30.5μGy/h;辐射剂量范围,10 - 198.7 μGy/h)和 (2)低(CL,均值= 0.26 μGy/h;辐射剂量范围, 0.12 -0.55μGy/h,KL,均值= 0.31μGy / h; 辐射剂量范围 0.15-0.55μGy/h)。值得注意的是，CH站点包含显著高于CL和KL的辐射值(bonferroni校正的Kruskal-Wallis检验，df = 2χ2 = 115.4, P < 0.0001)，而后两个区域辐射剂量没有显著差异(χ2 = 115.4,df = 2, P = 0.718)。CEZ 总面积约2050平方公里(约30公里半径) 在CNPP附近)， 距基辅(Kyiv，KL)约80公里，我们的还研究了空间分隔对SK菌群，即对比分析CEZ内的区域(CH和CL) 和CEZ (KL)之外的区域的差异。

图1. 以点表示的堤岸田鼠捕获地点所在研究区域地图。图中显示了每个区域(例如CH1-3、CL1-2和KL1-2)内的重复站点，其中包括CEZ内的受污染区域(CH)和未受污染区域(CL)以及乌克兰基辅附近的未受污染区域(KL)。颜色的点表示环境辐射水平的差异, CH,红色(10 - 198.7μGy / h); CL,绿色(0.12 - -0.55μGy / h)和KL、绿色(0.15 - -0.55μGy / h)。虚线表示CEZ(面积~ 2050 km2)周围的边界。图是使用R中的ggmap v.2.6.1包创建的。

Fig 1. Map of the study areas with bank vole trapping locations shown by points. Replicate sites within each area (e.g. CH1-3, CL1-2 and KL1-2) are shown, with areas contaminated (CH) and uncontaminated (CL) with radionuclides within the Chernobyl Exclusion Zone (CEZ) and uncontaminated area near Kyiv (KL), Ukraine. Colour of the point indicates differences in environmental radiation levels, CH, red (10–198.7 μGy/h); CL, green (0.12–0.55 μGy/h) and KL, green (0.15–0.55 μGy/h). Dashed line represent the border around the CEZ (area of ~ 2050 km2). Figure was created using ggmap v.2.6.1 package in R.

放射量测定

Dosimetry

我们使用γ-spectrometry （γ-光谱测定法）来估算整只堤岸田鼠积累的放射性核素(137Cs负荷) 。堤岸田鼠体内¹³⁷Cs活性(n = 123，代表所有研究区域)使用SAM 940放射性核素识别系统(Berkeley Nucleonics Corporation, San Rafael, CA, USA) 配备NaI检测器进行测量。 估计¹³⁷Cs的负荷有所不同，从103.3到11,678,418.6 Bq/kg。居住在CH的动物与CL和KL的动物所受辐射剂量平均差异超过两个数量级(>高140倍)。因此，来自CH的田鼠所受辐射显著(χ2 = 66.01, df = 2, P < 0.0001, bonferroni修正的Kruskal-Wallis检验)高于CL和KL的负荷量，而后两者则没有显著区别(P = 0.227)。

研究者们还估算了外界环境对研究中的田鼠辐射量。外部辐射剂量变化从0.10 mGy到286.13 mGy，CH平均值在55.66 mGy左右，CL和KL分别为0.42和0.45 mGy。与¹³⁷Cs活动类似，动物在CH经历显著高于(χ2 = 65.96, df = 2, P < 0.0001, bonferroni检正的Kruskal-Wallis检验) CL和KL的外部辐射。但后两者无显著性差异（P = 0.477)。因此, 个体水平的剂量测定数据表明，居住在CH地区的堤岸田鼠长期暴露在严重的来自外部的辐射剂量区域)和内部污染源(例如，来自受污染的食物)的环境中。

拭子样本采集

Swab sample collection

用棉签拭取堤岸田鼠毛皮，对SK微生物进行了菌群采样(Epicentre Biotechnologies, Madison, USA)。采样时，拭子紧紧地压在胸背部，来回擦拭20次，然后立刻放入该款包含750μL缓冲溶液的MoBio动力珠管(MoBio Power Bead，卡尔斯巴德，美国)，并在DNA提取前将其保存于- 80℃(n总共取样157，其中CH n = 66, CL n = 44, KL n = 47)。为避免潜在的批次效应和系统偏差，样品从每一处理组进行处理都是随机的(如储存、运输，DNA提取，文库构建和测序)。本研究中的动物一律使用非侵入性取样，这也是另一项研究的一部分(Kivisaari等人未发表数据)，他们被安置在CEZ内的野外实验室，在单独的Makrolon III型笼中(43×26×15厘米)，并为它们提供锯末和干草以便它们做巢。提供食物(RM1，特殊的饮食服务)和饮用水。对动物的体长和头宽、体重进行测量，并精确到0.1mm或者0.1g。怀孕的雌性在她们生产后再测量。体重经常被用作一个指示年龄的指标，然而，很多因素会影响体重，例如母鼠的妊娠状况。因此，本研究按头宽将这些田鼠分为三个年龄组:幼体(~ 1 月，11.6-12毫米)和，亚成体 (~ 2 ~ 5个月，12.1 ~ 13.4mm），成体 > 10个月，>13.5mm。基于视觉的性别评估 (雄性63例，雌性94例， 即雄性、妊娠期、哺乳期或哺乳期的睾丸下降女性阴道穿孔的存在)结合测量数据，排除非常年幼的个体(~ 1 - 2周大)。

DNA提取和16S rRNA基因测序

DNA extraction and 16S rRNA gene sequencing

使用PowerSoil DNA抽取试剂盒(MoBio
Laboratories, Carlsbad, USA)从棉签样本中提取DNA (n = 157) 。16S rRNA基因的扩增和文库构建由芬兰分子医学研究所负责完成(FIMM, University of Helsinki)(www.fimm.fi)。 简单地说，16S rRNA基因的V4区域经多重扩增。 PCR反应采用515F/806R 引物并附带个体鉴定标签进行。PCR条件为如下: 98°C持续30秒，然后在98°C循环27次， 10秒，56°C 30秒，72°C 15秒然后72°C延伸10分钟。PCR产物体积相等，并纯化两次(AMPure XP PCR Purification kit)，使用0.8倍于纯化体积的磁珠进行纯化。最后文库是否使用需要用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒（Agilent High Sensitivity DNA
Kit）在安捷伦2100生物分析仪进行测定 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) 。16S扩增子在Illumina
MiSeq上使用PE250进行双端测序。

数据处理

Read data processing

采用FIMM依据标签序列对测序数据进行拆分为单个样本（de-multiplexed）。接头序列（adaptor）在PE模式下使用 TRIMMOMATIC v.0.35去除。 双端序列合并使用PEAR v.0.9.1装，并指定最短(-n290)和最长(- m294)的序列长度。经这些处理后留下8,012,677条序列，平均每样品有51,036条(范围= 36-247,393) ，进而使用QIIME v.1.9.1处理。 潜在的嵌合序列用UCHIME进行去除，保留下来的(无嵌合体)的数据使用SORTMERNA
和SUMACLUSTS进行半有考(Open-reference)可操作分类单元(OTUs)的预测。参考Greengene数据库，按97%相似原则对细菌进行分类。低丰度的OTUs被删除(< 0.005%的数据)。OTU表稀释取样为10268 reads/ 样品(6个样品由于数量不足在后续分析中去除）。堤岸田鼠SK菌群的核心组成是由存在于所有151个个体中的OTUs所定义的。最后 SK的微生物组分析代表1928个OTUs(平均值为在901 OTUs/样本范围内，范围= 562-1200 OTUs/样本)。

统计分析

Statistical analyses

除特殊说明外，采用R v.3.3.3进行统计分析。研究区域间菌群组成的alpha值的显著差异(丰富度-观测到的OTUs数量;均匀度, 香农指数)和群落组成使用Kruskal-Wallis确定，然后使用DUNN.TEST包进行Dunn’s事后检验和 Benjamini–Hochberg FDR或者 Bonferroni 校正多重分析。我们也完成了Spearman’s rank
相关分析，以检查 (1)外照射剂量(2)¹³⁷Cs 全身负荷和库田鼠SK菌群alpha多样性之间的潜在联系。

我们利用广义线性模型来确定影响SK微生物群落多样性的潜在预测因子(GLM)。完整模型中包含的解释变量包括性别(雄性|雌性)、体重、头部宽度(代表年龄)、研究区域(CH, CL和KL)和通过宿主性别交互作用研究区域(*)。模型选择基于Akaike信息准则(AIC)进行了调整，并使用AICc对模型进行排序，以确定样本大小。 两个AICc中最简约的模型中AICc值最低的那一个被认为是支持相关的最佳模型。利用MUMIN v.1.15.6中的DREDGE函数进行模型选择。

Beta多样性是利用Bray–Curtis差异矩阵和未加权UniFrac距离来估计样本之间的差异（Bray–Curtis dissimilarities and unweighted UniFrac distances），由PHYLOSEQ v.1.19.1计算。样品间的差异用主坐标分析(PCoA)，并采用置换方差分析( PERMANOVA)进行统计学检验， 这些检验由VEGAN v.2.4-2中的ADONIS函数实现。

采用随机森林机器学习分类方法，根据微生物群落组成确定堤岸田鼠SK菌群定位的准确性。模型使用RANDOMFOREST在QIIME v.1.9.1中实现，每个模型有1000棵树和10倍交叉验证误差估计。模型检验了来自CEZ内外的堤岸田鼠SK微生物群分配成功率，即（1）受污染组和未受污染组之间的对比；（2）三个研究区域(CH、CL和KL)之间的对比；(3)所有七个研究区域之间的对比；也就是重复取样地的对比。

对SK微生物群数据的处理与对GI数据的处理类似 （ID 11360, EBI accession number ERP104266）。 为了比较SK和GI微生物群落在多样性和群落结构上的空间尺度差异，我们分析了同一田鼠的微生物组数据(共93只，CH n = 36, CL n = 28, KL n = 29个样本)。 在GREENGENES v.13_8数据库中没有匹配基因的情况下删除了OTUs，并将两个微生物组数据集精简为等效的9250 reads/样本。SK和GI数据中Alpha和Beta多样性的空间差异使用上述的同样方法。我们使用QIIME v.1.9.1实现Mantel检验(999个排列)来检验样本地理距离与微生物群落差异相关水平之间的相关性(Bray–Curtis和unweighted UniFrac)
我们完成了对SK和GI微生物群的Mantel测试：(1)针对所有对样本，(2)仅针对CEZ内的成对样本。最后，我们使用随机森林模型
对比SK和GI微生物组样本分配到其研究区域的预测准确性。

结果

Results

堤岸田鼠皮肤微生物组成

Bank vole SK microbiome composition

利用16S rRNA基因测序技术，对157只野生捕获岸田鼠的SK菌群进行了定性分析，这些田鼠来自环境放射性核素污染水平不同的地区(图1)。鉴定出来自15个细菌不同门的1928个OTU。变形杆菌(34%)，厚壁菌门(28%)，放线菌(16%)、拟杆菌门(16%)和蓝藻门(4%)，这五个类群占据了97%的丰富度。变形菌门中的丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria）占据主要优势（20%），其次是放线菌，梭状芽胞杆菌，杆菌丰度大致相同（14%）。这种群落组成可与其他非人类哺乳动物的SK微生物群相媲美。这种田鼠SK微生物群由乳杆菌属节杆菌、葡萄球菌、不动杆菌、以及蓝藻OTUs组成核心成员。由于几乎所有的OTUs都不局限于一个研究区域，微生物类群丰度的变化导致SK菌群多样性和群落结构的空间差异如下。

图2. 测定居住在环境辐射水平不同地区的田鼠皮肤微生物群的alpha多样性。箱线图表示alpha多样性估计的中值和四分位数范围(即观察到的OTUs数量、Shannon指数)。每个方框图代表一个来自受污染区域(CH1-3)和未受污染区域(CL1-2)的实验重复站点，其中放射性核素区域排除CEZ乌克兰基辅(KL1-2)附近的区域和未受污染地区。

Fig. 2 Measures of alpha diversity for the skin microbiome of bank voles inhabiting areas that differ in levels of environmental radiation. Box-andwhisker plots represent the median and interquartile range of alpha diversity estimates (i.e. number of observed OTUs, Shannon index). Each box plot represent a replicate site from contaminated (CH1-3) and uncontaminated (CL1-2) with radionuclides areas within the Chernobyl Exclusion Zone and uncontaminated area near Kyiv (KL1-2), Ukraine

SK菌群组成的alpha和beta多样性

Variation in SK microbiome alpha and beta diversity

SK菌群的alpha多样性受性别和地理位置的影响，却不受核辐射污染的影响。外部受辐射的剂量和全身承载的¹³⁷Cs辐射都与SK菌群不呈显著的相关关系。而受污染区内的两个样地（CEZ内）的alpha多样性显著高于CEZ区域外的样地（图2）。我们还注意到同一区域内两个重复样地之间SK菌群存在较大的变异，如来自红森林（Red Forest）及其临近区域的样本具有较多的特有OTUs。无论是体重还是头部宽度(年龄的代用指标)都与SK菌群alpha多样性无关。有趣的是，雄性田鼠的alpha多样性(OTUs和Shannon指数)显著高于雌性(P < 0.05, GLMs)，但在处理交互作用下性别差异不显著。没有专门的SK微生物类群仅发现于一个性别, 相对丰度的大部分主导(前十)细菌属(例如, 不动杆菌, 葡萄球菌和假单胞菌)不同性别SK微生物群落之间也没有显著差异。相比之下，乳杆菌属的细菌相对丰度有显著差异，乳酸菌属的丰度上雌性田鼠两倍于雄性(P < 0.0001, Kruskal-Wallis test)。 然而，在雌性中，乳酸菌的变异并不依赖于妊娠状态(P = 0.16, Kruskal-Wallis检验)或幼崽数量 (r = 0.13, P = 0.23, Spearman’s相关分析)。

SK微生物群落结构的变异强化了alpha多样性的格局。来自CH和CL的田鼠SK微生物组样品具有明显重叠的成簇特征，这些簇主要在第二个PCoA轴上与KL样品分离（图3）。因此，田鼠 SK微生物群落在研究区域间存在显著差异(P = 0.001, PERMANOVA)，来自CEZ内部或外部的样本来源基于分类单元丰度(Bray-Curtis dissimilarity)和群落成员间的系统发育距离(未加权的UniFrac)，是SK微生物群beta多样性的主要预测因子。

值得注意的是，基于外部辐射剂量和全身¹³⁷Cs放射性核素负荷，辐射对SK微生物群落结构没有显著的预测作用(P > 0.05, PERMANOVA)。与故意的非均匀采样一致，我们观察到显著性
(P = 0.001, PERMANOVA)复制位点和这个分组之间beta多样性的差异占未加权变异的13%和17%UniFrac距离和Bray-Curtis不相似矩阵。  与alpha多样性相似，寄主性别对beta多样性的总变异有显著的贡献(P < 0.002, PERMANOVA)，没有明显的性别交互作用研究区域。田鼠体重和头部宽度对SK菌群结构的解释无统计学意义。因此，地理位置
(CEZ内、外)、田鼠诱捕位点和寄主性别是库田鼠群落结构和多样性的主要预测因子，环境放射性核素对其影响不显著。

图3. 与环境辐射暴露相关的堤岸田鼠皮肤微生物组beta多样性差异。基于Bray-Curtis距离的PCoA，在三个研究区域中对田鼠皮肤微生物群谱的差异距离进行了研究。每个点代表一个样本(n = 151)，形状代表寄主性别，按研究区域着色: CH，红色(n = 64); CL，蓝色(n = 44); KL，绿色(n = 43)。 椭圆表示围绕聚类质心的95%置信区间(CI)。

Fig. 3. Differences in bank vole skin microbiome beta diversity associated with environmental radiation exposure. PCoA on Bray–Curtis dissimilarity distances between bank vole skin microbiome profiles among the three study areas. Each point represents a single sample (n = 151), shape indicate host sex, coloured according to study area: CH, red (n = 64); CL, blue (n = 44); KL, green (n = 43). Ellipses represent a 95% CI around the cluster centroid.

基于SK菌群组成预测田鼠的来源

Bank vole origin can be predicted from SK microbiome community composition

随机森林学习进一步支持了地理位置而不是环境放射性核素水平影响田鼠SK微生物组组成。随机森林模型正确地分类了来自内部(CH和CL)和外部的样本(KL) CEZ的94% (SD =5%)的时间;这一精度比随机预测的精度高出4.8倍左右。 而来自CEZ的107个样本中只有一个被归类为KL。 该分类方法能够正确地将样本分配到三个研究区域(均值)
= 80%，±SD 11%)和7个复制位点(75±9%)，但模型错误率较低(分别为2.8和3)
(对随机森林分类器的估计泛化误差进行随机猜测时的基线误差)。这种预测准确性的下降是由于CEZ中CL和CH SK微生物群的相似性造成的。例如， CL1中只有不到17%的样本被正确分配，而是被归类为CH1(56%)或CH2(22%)。因此，来自CL的复制的高类错误表明，模型无法确定样本是否来自于
CEZ(附加文件11)，尽管意义重大(参见
上述“方法”部分)居住在这些地区的动物的外部辐射暴露水平和内部放射性核素负担的差异。

图4. 与环境辐射暴露相关的肠道和皮肤微生物组beta多样性差异。在三个研究区域中，Bray-Curtis与堤岸田鼠(a)肠道和(b)皮肤微生物群剖面之间的距离不同。每个点代表一个样本(n = 93)，形状代表寄主性别，按研究区域着色: CH，红色(n = 36); CL，蓝色(n = 28); KL，绿色(n =29)椭圆表示每个研究区域复制位置的聚类质心周围75%的CI。(c)肠道和(d)皮肤微生物群落差异与地理d的相关性。采用Mantel检验相关显著性; 直线表示线性回归模型。

Fig. 4 Differences in gut and skin microbiome beta diversity associated with environmental radiation exposure. PCoA on Bray–Curtis dissimilarity distances between bank vole (a) gut and (b) skin microbiomes profiles among the three study areas. Each point represents a single sample (n = 93), shape indicate host sex, coloured according to study area: CH, red (n = 36); CL, blue (n = 28); KL, green (n = 29). Ellipses represent a 75% CI around the cluster centroid for each study area replicate site. Correlation between (c) gut and (d) skin microbiome communities dissimilarity and geographical distance (km) among bank vole trapping locations. The correlation significance was tested using Mantel tests; lines denote the linear regression model.

比较SK与GI菌群的差异

Comparative analysis of the SK and GI microbiomes

堤岸田鼠SK和GI微生物群落对不同的环境诱因有明显的反应，因此它们的结构在不同的空间尺度上形成（图4）。因此，地理位置决定了SK菌群alpha和beta多样性的显著差异，这与GI菌群的群落组成和多样性形成了明显的对比，其alpha和beta多样性是由放射性核素污染程度而不是地理位置决定的。因此，虽然三个研究区GI微生物组的alpha多样性(丰富度和均匀度)差异不显著(P > 0.05, Kruskal-Wallis检验)(且定量上KL较高)，但相比较SK微生物组alpha多样性在CEZ区域内显著较高。此外，SK和GI微生物群落均表现出明显的不同聚类(P < 0.001, PERMANOVA)(图4a,b)，来自CEZ的SK微生物组样本(即来自CEZ的样本)有明显的重叠)，而GI微生物组样本则是根据放射性核素水平聚集在一起的(即，尽管这些位置之间的距离约为80公里，但CL和KL之间重叠最多）。

随着田鼠诱捕地点之间地理距离的增加，堤岸田鼠SK菌群之间的差异越来越大(r = 0.241, P = 0.001，Bray-Curtis;r = 0.222, P = 0.001未加权的UniFrac, Mantel test，图4d)，进一步增强了空间距离对SK菌群的贡献。相比之下，GI微生物群落的相似性相对较弱，如果有的话，这与样本之间的距离有关(r = 0.087, P = 0.011 for Bray–Curtis; r = 0.016, P = 0.706 for unweighted UniFrac, Mantel test, Fig. 4c)。在CEZ中，我们发现GI微生物群的群落差异与地理距离显著正相关(r = 0.163，仅Bray-Curtis Mantel检验P = 0.001 (SK微生物组，r = 0.071, Bray-Curtis Mantel检验P = 0.121)。

考虑到CEZ内不同区域GI微生物群的差异是由细菌OTUs的丰度变化而不是分类单元替代引起的，因此使用未加权的分析结果并不令人惊讶。UniFrac作为距离度量对SK和GI菌群均不显著(r = 0.072, P = 0.155, r = 0.065, P = 0.267, Mantel test)。有趣的是，暴露于土壤放射性核素(或潜在暴露于土壤放射性核素)与SK和GI微生物群的不同程度的梯度有关:KL最高，CL为中间值，CH最低。最后，随机森林模型对SK和GI微生物群落具有相似的预测精度(分别为77%和80%)。但是，该分析不能可靠地区分CL和CH的SK菌群，也不能区分CL和KL的GIL菌群(图6)。这进一步导致CL(图6)个体的类误差估计不断升高，CL倾向于与CH或KL结合，这取决于微生物群的取样来源。

图5. 每个研究区域内GI和SK微生物群落的差异性。箱线图表示样本间Bray–Curtis距离的中值和四分位数范围。每个方框表示CEZ区域污染(CH)和未污染(CL)样地与乌克兰基辅附近的区域的对比。

Fig. 5 Community dissimilarity between gut and skin microbiomes within each study area. Box-and-whisker plots represent the median and interquartile range of Bray–Curtis distance between samples. Each box plot represent contaminated (CH) and uncontaminated (CL) with radionuclides study areas within the Chernobyl Exclusion Zone and uncontaminated area near Kyiv (KL), Ukraine.

图6. 使用随机森林分类对来自CEZ受污染区(CH)与非污染区(CL)以及乌克兰基普附近（KL）堤岸田鼠的SK和GI进行对比分析。 a. RF分析的混淆矩阵的每一行表示研究区域，颜色强度表示组内一致性，对应分类器预测的样本占每一列指定研究区域的比例。b.分类误差估计表明每个研究区域的完整性，给出了皮肤和肠道微生物群落分析。

Fig. 6 Random forest (RF) classification of skin and gut microbiomes associated with bank voles inhabiting areas contaminated (CH) and uncontaminated (CL) with radionuclides within the Chernobyl Exclusion Zone and uncontaminated area near Kyiv (KL), Ukraine. a Each row of the confusion matrix from RF analysis represent the study area, the colour intensity indicates within-group coherence and correspond to the fraction of samples that were predicted by the classifier to belong to the study area specified by each column. b Class error estimates indicate the integrity of each study area given the skin and gut microbial communities analysed.

讨论

Discussion

虽然来自皮肤(SK)和胃肠道(GI)的微生物群落对宿主健康有着不同的影响，但对野生动物群落结构和多样性的形成过程却知之甚少，尤其是在人为栖息地影响方面。本文首次分析了哺乳动物SK菌群对环境放射性核素污染的反应，并对SK菌群与GI菌群的差异进行了比较。与我们的预测相反，接触放射性核素对田鼠SK菌群影响较小; 相反，居住在CEZ的田鼠比来自CEZ之外的田鼠具有更高的SK微生物群多样性。在个体水平上，雄性岸田鼠有较高的SK微生物多样性。最后，SK和GI菌群对环境的反应不同，SK菌群的形成更多地受地理位置的影响，而GI菌群则受放射性核素水平局部变化的影响。

堤岸田鼠的SK菌群是多种多样的，其群落结构与其他非人类哺乳动物，尤其是啮齿动物的基本相似。例如，类似于我们对堤岸田鼠的数据，变形菌，放线菌和杆菌是其他啮齿动物SK菌群的优势菌纲，包括松鼠（Sciurus carolinensis），土拨鼠（Marmota monax)，以及蝙蝠和家犬。 在这些微生物纲级单元中，来自Acinetobacter, Staphylococcus ( S. succinus), Lactobacillus ，Pseudomonasgenera 属的成员与堤岸田鼠以及人类和其他哺乳动物的SK菌群有关; 高度普遍性(即在所有样本中均发现)和丰度(即在最丰度前10属内)表明它们是堤岸田鼠SK菌群的核心组成成员: 确定这些细菌在堤岸田鼠SK菌群中的功能作用是未来研究的一个方向。

环境对SK菌群的影响

Environment effects on SK microbiome

大多数针对非人类哺乳动物的SK微生物群研究都是在圈养动物身上进行的，只有少数研究考察了自然界中哺乳动物中的SK微生物群。因此，我们对环境和宿主特性的贡献知之甚少，例如，性别在塑造野生哺乳动物SK微生物群落中的作用。我们的研究结果与常见的自由生活细菌(例如，土壤相关细菌)的发生是一致的。因此，野生啮齿动物的SK菌群主要受相对较大空间尺度(~ 80 km，距离河岸最小距离)环境变化的影响。

寄主对SK菌群的特有影响

Host-specific effects on SK microbiome

值得注意的是，关于寄主特征(如性别)对野生动物SK微生物群落组成的影响，我们知之甚少。在堤岸田鼠中，头部宽度或身体重量的变化(例如，反映年龄或生长的差异)对SK微生物群落多样性几乎没有影响，但寄主性别很重要。性别偏向的微生物群落差异很少报道，尽管SK微生物群落的多样性在人类女性中高于男性。尽管如此，性别是红袋鼠SK菌群的重要预测因子，但对猫、狗和马(主要是家养或圈养动物)却没有影响。乳酸菌（Lactobacillus）在母鼠SK菌群的的双倍增减与人类一致。乳酸菌属的成员支配阴道微生物群，在雌性SK菌群中含量较高。性别差异导致SK菌群存在差异可能是一种普遍现象。SK菌群的性别差异也可能反映了影响环境类型的行为差异，从而影响所经历的微生物群。例如，作为许多哺乳动物的典型，雄性田鼠倾向于更多地去觅食或寻找配偶。更大的活动可能为雄性田鼠提供机会使它们获得更多样化的微生物群，例如，类似于生活方式(例如，在室内或室外呆的时间;居住在农村或城市环境中的;暴露于自然生物多样性)对动物和人类SK微生物多样性具明显影响。

暴露于放射性核素污染的影响

Effect of exposure to radionuclide contamination

虽然人类活动改变生境对生物多样性产生了广泛的负面影响，但暴露于环境放射性核素污染并不一定会减少微生物的多样性。这可能很奇怪，因为SK微生物群落主要来自于环境，而对生物多样性有负面影响的过程预计会对SK微生物群产生伴随影响。 与KL相比，CEZ中SK菌群的多样性较高，这与无脊椎动物的研究形成了对比和微生物群落暴露于切尔诺贝利放射性尘降物中，其中放射性核素水平升高对生物多样性有负面或没有影响。与我们的研究结果相似，红森林中放射性废物处理沟槽内的土壤微生物多样性要高于周边区域。森林凋落物在CEZ内的污染区域(包括红森林)累积，考虑到堤岸田鼠居住在洞穴中并在凋落物周围活动，这可能增加了其获取微生物群落的可用微生物生态位空间。奇怪的是，在CEZ内受污染地区森林垃圾的积累意味着微生物分解者或土壤无脊椎动物的功能受损。因此，CEZ内的高SK微生物群多样性(以及周围环境中的高微生物多样性)似乎与健康的生态系统功能无关。物种多样性估计没有考虑到物种对生态系统服务的生态作用和不同贡献。

SK微生物群是动物生活的重要组成部分，红色森林(CH1)和邻近地区的独特OTU数量最高(图2)，这可能反映了与放射性核素暴露相关的高突变率。虽然SK微生物群alpha多样性与居住在这些地区的动物的外部辐射剂量或内部放射性核素(¹³⁷Cs)负荷之间没有相关性。

没有详细的CEZ生境描述，这将允许验证特定环境变量对田鼠 SK微生物群组成的潜在作用(?)。尽管如此,历史记录表明,红森林具有更高的可用细菌多样性，可能因为事故发生后大量的森林碎片, 植被和土壤从这个区域被推平进战壕, 埋在核事故发生地点，这可能创造了具高微生物多样性的潜在区域。CEZ区域SK微生物群的alpha多样性增加另一个可能原因是人类活动的缺乏，从而限制了该地区的土地利用(例如林业、农业)。CEZ区域位于白俄罗斯境内大型哺乳动物密度的提高可能归因于人类影响的减小。两个KL重复采样点都位于连续的、基本未受干扰的森林中。然而，由于这些地点对人类来说是可以到达的，而且相对接近基辅(欧洲人口第七多的城市)，因此有可能对环境生物多样性造成人为影响，这可能导致相关的微生物多样性减少。

SK和GI菌群的比较

Comparison of SK and GI microbiomes

SK和GI菌群在群落多样性上存在内在的差异，对不同的环境诱因有明显不同的响应。堤岸田鼠SK比GI具有更高的多样性，这与人类的情况一致，但不同于其它野生动物。SK和GI微生物群落对宿主健康有重要的影响，但两者之间存在比较研究，且来自同一个体的GI和SK微生物群的工作是非常罕见的。虽然预测微生物群落的不同与空间分离之间存在正相关关系是合理的，但这对SK来说显而易见是正确的，但对GI来说，却并非如此。唯一一项比较野生哺乳动物SK和GI微生物群的研究（袋獾）同样也发现地理因素只对SK菌群有显著影响，而SK和GI菌群在寄主被圈养的情况下明显地聚集在一起。我们对受污染地区(相距约7-34公里)和未受污染地区(相距约9-80公里)进行重复采样，可能会增加噪音，但对消除特定地点的其他环境因素对辐射暴露(如果有的话)的潜在影响至关重要。个体水平的剂量测定数据估计了田鼠(1)外部辐射暴露和(2)全身辐射负荷，表明从CH采集的田鼠暴露于较高水平的辐射中，但这种暴露对SK微生物群组成几乎没有显著影响。因此，令人惊讶的是，GI，而不是SK，微生物群对土壤核辐射局部升高有反应。

与GI菌群相似，SK菌群与宿主免疫系统有重要的作用。宿主相关的微生物群可以是共生的、互利的或致病的，也可以根据环境背景(如宿主的炎症和代谢状态)改变它们与宿主的关系。
虽然取样样本田鼠的炎症状况尚不清楚，但对脾脏转录组进行分析(Kesaniemi等人未发表的数据)发现，居住在CEZ污染区域内的田鼠存在适应性免疫系统抑制(抗原处理受损)的迹象。环境压力可能通过微生物群落的变化对宿主健康产生影响，例如将一些共生物种转化为机会性病原体和/或炎症触发。对GI和SK细菌功能的进一步研究，以及对宿主免疫状态的直接测量，可能有助于阐明这两个微生物群之间的机制差异(如果有的话)，并揭示对田鼠健康有影响的关键因素。

健康个体内的SK和GI微生物群应该是不同的，这反映了它们在各自截然不同的生态位上的选择: 胃肠道(结肠区域)主要由密集的厌氧菌群组成，这些厌氧菌群促进消化，而皮肤则承载着多样的，但是生物量非常小的微生物群，且能够容忍相对匮乏的营养条件。 考虑到这一点，SK和GI微生物群之间越来越相似的模式与居住在CEZ污染区域有关。这可能反映了鼠群SK菌群中粪便细菌的增多。例如，S24-7家族的成员几乎只在恒温动物的肠道中发现(并且在堤岸田鼠肠道中占据46%)也存在于堤岸田鼠的SK菌群中，来自KL的数量约为CL和CH的两倍。

SK菌群中GI菌群影响增加的一个可能原因可能是与居住在受污染环境有关的自我修饰行为的改变; 例如，梳理毛发较少的动物会在受污染的土壤中摄入较少的放射性颗粒。另外，自我修饰的减少可能表明长期的压力反应。鉴于SK和GI微生物群落在健康方面都发挥着重要作用，确定个体内微生物群落的这种明显均质化是否为与核辐射相关的一种生物失调值得深入研究。

暴露在高水平的电离辐射下可能对生物造成选择性压力，而居住在CEZ污染区域内的生物可能需要适当的进化反应。SK微生物群可能已经适应了放射性核素的暴露，尽管这一解释未能解释在同一田鼠宿主内经历类似辐射暴露的SK和GI微生物群所表现出的不同空间尺度的群落结构。细菌似乎不太可能从胃肠道天生对辐射更敏感。虽然从土壤暴露在外部剂量放射性核素可能影响SK和胃肠道微生物,微生物群栖居于胃肠道也可能受到内部高剂量的辐射污染食物，作为内部暴露于放射性核素贡献高达30%的总辐射吸收剂量田鼠栖息CEZ。此外，由于SK菌群是通过与环境的接触来确定的，而GI菌群在很大程度上是由宿主的饮食来塑造的，所以GI和SK菌群的差异可能仅仅是由于空间变异造成的。 例如，在GI菌群的显著变化可以反映CEZ污染区内无脊椎动物群落生物多样性的减少. 事实上，宿主饮食对胃肠道微生物群有直接的影响。因此，田鼠的GI微生物群可能会发生变化，并对环境做出更快的反应。相比之下，CEZ内田鼠SK菌群变异相对较少，反映了田鼠在觅食和/或寻找配偶时，在运动过程中不断获取和沉积环境微生物的过程。因此，在放射性核素污染对SK菌群分类学组成没有强影响的情况下，SK菌群的分化在更大的空间上发展.

结论

Conclusions

哺乳动物SK菌群的变化主要是由栖息地和寄主性别的环境差异所决定的，而不是由放射性核素污染水平所决定的。居住在CEZ的堤岸田鼠的特征是高SK菌群多样性，可能反映了缺乏人为干扰。本研究显示SK和GI微生物群落在不同的空间尺度上是如何变化的，这可能反映了环境和宿主饮食在空间变化上的不匹配。最后，我们证明居住在被放射性核素污染的地区有可能具有使同一个体的SK和GI微生物产生同化的趋势。未来的工作将需要研究SK群落结构和多样性变化的适应性(如果有的话)影响，以及微生物群落均质化的适应度结果。目前还不清楚我们的发现是针对田鼠、啮齿动物的，还是其他物种间更普遍的相似模式。因此，我们建议未来的研究应该集中在多个微生物群落的大量宿主，进而对环境-宿主-微生物相互作用进行更广泛的推断。

展望

这一项研究目前仅关注了CEZ区域一个物种SK和GI菌群对核污染的响应，而未对不同的类群进行对比，也没有对菌群的功能进行细致的分析，下一步的研究可以在这两个方面深入。

参考文献

Lavrinienko A, Tukalenko E, Mappes T, Watts PC. 2018. Skin and gut microbiomes of a wild mammal respond to different environmental cues. Microbiome 6(1):209. https://doi.org/10.1186/s40168-018-0595-0

Lavrinienko A, Mappes T, Tukalenko E, Mousseau TA, Møller AP, Knight R, et al. Environmental radiation alters the gut microbiome of the bank vole
Myodes glareolus. The ISME Journal. 2018;12:2801–2806.

本文译者简介

葛德燕博士，中国科学院动物研究所副研究员。2009年博士毕业于中国科学院动物研究所，2011年中国科学院动物研究所动物学博士后流动站出站。目前已发表科研论文和专著近50篇。2019年初加入宏基因组编辑团队。

猜你喜欢

• 10000+: 菌群分析
  宝宝与猫狗 提DNA发Nature 实验分析谁对结果影响大  Cell微生物专刊 肠道指挥大脑
• 系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组
• 专业技能：生信宝典 学术图表 高分文章 不可或缺的人
• 一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树
• 必备技能：提问 搜索  Endnote
• 文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical
• 扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图
• 16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun
• 在线工具：16S预测培养基 生信绘图
• 科研经验：云笔记  云协作 公众号
• 编程模板: Shell  R Perl
• 生物科普: 肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘  

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍末解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

学习扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

点击阅读原文，跳转最新文章目录阅读
https://mp.weixin.qq.com/s/5jQspEvH5_4Xmart22gjMA