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根系分泌物驱动土壤记忆抵御植物叶际病原菌

Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection

撰文：文涛 南京农业大学

责编：刘永鑫 中国科学院遗传与发育生物学研究所

导读

根际作为土壤中微生物最为活跃的热区之一，不仅微生物的相互作用异常复杂，同时微生物同植物的互作也交融其中，给根际的研究带来巨大的挑战。这个过程中根系分泌物由于其成分复杂性和多样性被认为是目前已知的唯一可以组织根际对话的媒介。然而微生物群落组成也十分复杂，使用现阶段的技术和方法来探索根际的根际互作困难重重。本研究结合基因组学和代谢组学两大方法，从代谢层面和微生物组成层面尝试探索根际互作。希望能为以后相关的研究提供帮助。

植物与微生物组互作模式图

摘要

背景：自然抑病土壤的形成及其微生物组成结构表明植物能在根际组建有益的微生物群落。但是目前我们并不清楚植物叶部感染病原菌后是否，以及如何影响根际微生物群落。在本研究中，我们通过人工叶部病原菌Pseudomonas syringae pv tomato (Pst)入侵连续五季种植拟南芥，并在第六季测定拟南芥植物表型特征及其根感染后植株的根系分泌物在招募根际有益微生物方面的作用。

结果：生长在病原菌诱导过的处理土壤中可以提高拟南芥茉莉酸水平并且提高植物抗病性；16S rRNA基因扩增子测序表明在病原菌入侵后土体土壤(非根际土)和根际土壤中微生物群落发生了改变。GC-MS表明，被侵染后的植物会分泌更多的氨基酸，核酸和长链有机酸，但糖类物质，短链有机酸含量下降。土壤培养实验表明添加氨基酸和长链有机酸混合物提高植株抗病性。

结论：我们的结果表明被病原菌侵染的植株可以通过改变根系分泌物成分招募有益微生物群落，并促进后代植物对病原菌的抗病能力。

背景

在自然界中，植物会持续不断的受到来自各种有害病原菌的入侵。土壤会帮助植物抵御病原菌入侵，即使是在气候条件等有利于病原菌入侵的情况下。到目前为止，多种自然抑病型土壤陆续被报道，其中最为著名的是2002年小麦全蚀病抑病土壤的发现，随后马铃薯赤霉病，草莓和香草的镰刀菌枯萎病，甜菜的立枯丝核菌枯萎病等相应的特异性抑病型土壤陆续被发现。一些案例表明，抑病型土壤的抑病能力与土壤中特定的有益微生物富集有关。究其原因，这些富集的有益微生物可以分泌抗生素类物质直接抵御病原菌入侵，但近年来发现有益菌可以激活植物免疫系统，例如ISR（induced systemic resistance），来间接性的协助植物抵御病原菌。抑病土壤微生物群落的形成，往往是单一作物连续种植并在特定的病害剧烈的爆发几次之后。根据这一现象的导致了这样的假说出现：在受到病原菌攻击后，植物会招募并富集特定的有益微生物群落。这一假设被称为“cry for help”也就是著名的求救假说。一些证据表明小麦和辣椒抵抗病原菌的能力来自于作物自身调控的根际微生物群落的反馈。有证据表明拟南芥的在受到病原菌Pst入侵后，会大量分泌苹果酸，并通过苹果酸招募枯草芽孢杆菌FB17，诱导ISR免疫反应。其实野生的拟南芥也会在自己的根系周围招募特定的微生物群体。最近的证据表明在拟南芥被霜霉病病原菌Hyaloperonospora arabidopsidis入侵时，三株菌：Xanthomonas sp., a Stenotrophomonas sp., 和 Microbacterium sp会在感染的植株根际大量富集，后续实验也表明在霜霉病感染的拟南芥根际接种这三株菌，可以增加植株的抗病能力。该研究同样表明如果第一季植株感染霜霉病，第二季种植于相同土壤的植株抗病性会得到增强。这些证据表明了植物招募的有益微生物可以形成土壤记忆，或者作为上一代植物留给下一代植株的遗产，将帮助下一代植株更好的抵御病原菌入侵。虽然缺乏证据，但是我们相信根系分泌物或者植物主导的一些过程在土壤记忆的形成中起着重要作用。在我们的研究中，使用叶病原菌入侵植株并评估根系分泌物在土壤记忆形成过程中的作用。我们通过在相同的土壤上连续种植五季拟南芥，每季拟南芥接种病原菌Pst，在随后的第六季拟南芥种植过程中，我们评估拟南芥生长状况和激素水平，使用高通量测序追踪土壤和根际细菌群落变化，使用非靶向代谢组学技术鉴定根系分泌物差异，并评估差异分泌物在促进土壤抗病性方面的作用。结合以上技术手段我们将探讨根系分泌物在植物激活土壤记忆过程中的作用。

结果和讨论

1 病原菌影响的土壤对植物形态的影响

设置了接种病原菌处理和对照（接种方式参见材料方法），我们连续种植了五季拟南芥。种植第六季时，接种病原菌，统计拟南芥发病率。结果表明通过病原菌诱导连续种植五季后的土壤显著降低发病率（p < 0.05, t检验，图1B）。之前有研究指出，若同一区域的上一代植株经历过病原菌的侵染，则后代作物会增强对病原菌抗病能力，本文的研究结果与其相一致。其次我们发现在在未接种病原菌的情况下，第六季对照组的拟南芥植株地上部干重显著高于种植在病原菌诱导处理组。考虑到植株的抗逆行为会影响植株的正常代谢活动，当病原菌入侵，植物必须从营养生长过程转向抗逆过程时，植株的正常生理代谢减缓，生长速度降低。为此，我们测定土壤的pH和各种速效养分(NH₄⁺, NO₃^-, AP, 和 AK)，结果表明了两种土壤的速效养分含量并没有差别，虽然没有测定更多的有效营养元素，但是足以表明并非是营养差异造成了生理差异。接着我们检测了第六季未接种病原菌的植株的三种参与植物抗逆过程的激素：茉莉酸，水杨酸，和脱落酸。结果为茉莉酸在病原菌诱导处理组显著高于对照，水杨酸含量相反，脱落酸没有明显变化，也就是说前五季的土壤记忆诱导植株提高其自身茉莉酸浓度，减少水杨酸浓度，这与我们知道的这两中激素参与的代谢通路此消彼长的关系相吻合。表明了病原菌入侵后形成的土壤记忆可能是通过诱导植物提高茉莉酸水平从而提高植株抗逆性水平。虽然脱落酸可以参与植物防御过程，本文没有检测到两组之间的差异，可能是因为ABA主要参与非生物胁迫的调控，本文病原菌并不能激活ABA通路。

以上结果都表明了土壤中存在非营养因素改变了植株的抗逆水平，生长速度等生理过程。这一因素也就是我们将在下文中提到的土壤记忆或者土壤遗产。

需要补充说明的是：土壤记忆的形成并非是土壤中的病原菌的作用，因为我们添加病原菌仅仅只在叶片上，并且是在植株生长两周后。我们还检测了是否存在叶部病原菌进入土壤，但是结果表明病原菌的数量是低于检测极限的。这一现象促使我们继续本文的工作，检测土壤微生物群落。

图1. 病原菌诱导土壤对植株发病率，鲜重以及激素的影响

A. 在相同土壤连续栽培五季拟南芥，第六季拟南芥用于评估植株发病率。如图数据表明病原菌诱导处理植株发病率显著降低；

B. 第六季拟南芥地上部鲜重数据表明病原菌诱导土壤降低拟南芥地上部鲜重；

C. 第六季拟南芥植株用于三种激素的测定，结果表明病原菌诱导组茉莉酸含量增增加，水杨酸含量降低。处理组和对照组脱落酸含量无差异；

++注释++：
病原菌诱导处理组：每季拟南芥叶部接种病原菌Pst，并在相同的土壤连坐五季得到病原菌诱导处理土壤;
对照组：每季拟南芥叶部接种无菌水，在相同的土壤连作五季得到对照处理土壤。

2 叶部病原菌入侵对土壤细菌群落的影响

基于病原菌诱导处理和对照处理，我们在未接种病原菌的条件下对
第六季拟南芥根际土和土体土壤细菌群落进行了测定。一共36个样品，每个样品大概测得了25000条序列（clean seq）。这些样品中，土壤群落中ASV数量（ASV：基于DADA2得到的百分百非聚类unique序列数量）差异很大，数量在285到708之间，平均为467个。大部分ASV属于五大门：Proteobacteria (变形菌门：34.8%)，Acidobacteria(酸杆菌门：20.6%), Chloroflexi (绿弯菌门：16.1%), Actinobacteria (放线菌门：7.6%), 和 Firmicutes (厚壁菌门：5.9%)。尽管土壤已经种植了五季拟南芥，但是PCoA分析还是表明土体土壤和根际土壤具有显著差别的细菌群落（PERMANOVA：p = 0.001, R2 = 0.39)，这表明了植物根际影响有限。细菌群落在处理组和对照组之间差别很大，无论是土体土壤还是根际土壤。表明了地上部病原菌的侵染可以通过植物将这一影响传递到土壤微生物。本文注意到这一影响似乎是对土体土壤更大一些，表明了根际对于细菌群落的控制力。土体土壤在两个处理中差异显著，这足以表明了五季的病原菌入侵对土壤细菌群落的影响。就两组的土体细菌群落而言，病原菌诱导处理厚壁菌门的相对丰度显著上升，同时变形菌门的相对丰度减少。更详细的分类等级上，我们查找到两个ASV，分别属于Fictibacillus 和 Sphingomonas这两个属，虽然通过差异分析我们并没有鉴定出这两个ASV（p = 0.051 和 0.859），但是我们发现属于Fictibacillus的ASV在五个病原菌诱导的样品中含量超过20%，虽然其他4个样品和所有根际样品中该ASV相对丰度在1%以下。属于Sphingomonas的ASV在全部的根际样品和4个土体样品中的丰度在11%以上，然而在其余5个土体样品中丰度在2%以下。当我们去除这两个ASV之后，再次做PCA分析，发现置换检验依然表明两个处理群落差异依然显著，但受病原菌诱导处理的土体样品没有很好分离开来。包含这两个ASV的厚壁菌门和变形菌门差异也不显著。最近的研究表明了拟南芥感染霜霉病病原菌后会在根际招募三株特异的细菌协助植株抗病。这里我们的研究也表明了病原菌的入侵会在根际招募特定的ASV。我们对病原菌诱导的土体和根际细菌群落同各自的对照做差异分析发现，就土体细菌群落而言，两组中有三个ASV中差异；就根际细菌群落而言，五个ASV在病原菌诱导处理的根际样品中更高。值得注意的是无论是土体还是根际，有三个ASV在病原菌诱导的处理中显著富集，他们属于Roseiflexus。这些结果也表明了地上部病原菌入侵通过植物的信息传递，地下部会显著富集特定的微生物类群。

接下来我们移除了丰度最高的200个ASV，剩余ASV也同样表明了不同处理的微生物群落差异。这也表明了不仅是大量ASV还是稀有ASV都受到了这一影响并参与改变了群落组成信息。因此，我们在微生物群落中很难找出驱动这一变化的特定的ASV或者ASWV组合，换句话说，大量ASV可能参与影响植株的抗病性。总之，我们通过连续五季病原菌诱导实验培养得到了一个与对照完全不同的细菌群落。

图2. 叶部病原菌入侵对土壤细菌群落的影响

A. 我们队第六季种植的拟南芥根际和非根际土壤细菌群落进行扩增子测序，堆叠柱状图表明了四组微生物群落在门水平的物种相对丰度。

B. PCoA分析表明病原菌诱导处理改变了土体土壤细菌群落。

C,D. 三个ASV在两组土微生物群落间壤差异显著，五个ASV在两组根际微生物群落间差异显著，并且无论是土体还是根际有三个ASV在病原菌诱导的处理中显著富集，他们属于Roseiflexus属。

3 病原菌侵染对植株分泌物的影响

为了解释叶际病原菌如果通过植株影响土壤微生物群落，我们在无菌条件下收集了病原菌入侵后的根系分泌物并通过GC-MS测定全部小分子有机物。最终我们得到了456个高质量的特征峰。通过PCA分析我们发现接种病原菌后的根系分泌物不同于对照植株(p = 0.043 in ANOSIM）。我们将这456个特征峰匹配到数据库，并挑选得到高质量的相似度高的物质201种，并且这些物质在全部样品中能检测到。这些物质中有50种在两组之间差异显著。这些物质按照化学性质将其分为糖（31种），糖酸（7），糖醇（11），短链有机酸（29），长链有机酸（34），核苷酸（10），氨基酸（34）、酯（8）、醇（9），其他（28）当我们通过合并同类物质并进行差异分析，发现醇类物质，短链有机酸，糖类在对照中更高一些，而氨基酸，长链有机酸，糖酸，脂类在病原菌诱导处理组中含量更多。总的来说病原菌刺激下植株会分泌更多的长链有机酸，氨基酸，同时减少糖类物质的分泌，表明了糖类物质作为一种简单的碳源可能不具备对特定微生物的选择性，然而氨基酸，长链有机酸，短链有机酸这些稍微复杂的有机物酸类物质可能是一些特定微生物所偏好碳源，也就是说这些有机酸类碳源可能具备对特定微生物的选择作用。之前报道过短链有机酸尤其参与三羧酸循环的物质在植物根际可以招募有益菌，而在这里我们也将关注这些有机酸在招募有益为微生物方面的作用。

图3. 叶接病原菌对拟南芥根系分泌物的影响

A. PCA分析表明病原菌入侵显著改变了拟南芥根系分泌物指纹特征。

B. 热图中一共有201种分泌物，颜色深浅表明了接病植株多种根系分泌物含量不同于对照。而且这些物质变化趋势与其各自的分类相关。

C. 柱状图表明了接病处理醇类物质，短链有机酸，糖类分泌量减少，而氨基酸，长链有机酸，糖酸，脂类分泌量增多。

D. 热图挑选出代表接病组分泌增加的5种长链有机酸(十五烷酸，棕榈油酸，十六烷酸，十八酸，花生酸)和6氨基酸类物质(异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，色氨酸，鸟氨酸)以及分泌量减少的4短链有机酸(柠檬酸，乌头酸，琥珀酸，苹果酸)和6糖类物质(麦芽糖，核糖，葡萄糖，蔗糖，果糖，木糖)。

4 根系分泌物同植物抗病性的关系

为了更好的理解根系分泌物同土壤微生物的关系，我们模拟根系分泌物释放的过程，人工组合分泌物并模拟植物分泌过程连续添加到土壤中。根系分泌物分为四个类别：氨基酸类，长链有机酸类，短链有机酸类，糖类，（这些物质的名称参见材料方法）并将其长链有机酸和氨基酸组合为一组，短链有机酸和糖类物质混合为一组，使用这两个组合外加一个无菌水对照分别添加培养土壤。培养结束后我们提取土壤悬液并添加到混合了蛭石和石英砂的基质中。随后种植拟南芥并按照材料方法中提示的方式和时间在14天后接病，结果表明了长链有机酸和氨基酸组合的处理拟南芥具有更低的发病率。为了验证是否是其中的微生物起的主要作用，我们将悬液灭菌并做相同的发病率验证试验，发现灭菌后的长链有机酸和氨基酸处理的灭菌土悬液失去了作用，与对照具有相同水平的发病率。表明了长链有机酸和氨基酸组合培养土壤的抑病性提高是其中的微生物起着主要作用。

另外我们采用验证抑病型微生物群落的经典方法再次进行验证：将两组不同分泌物组合培养过的土壤按照比例(10%, 50%,  90% w/w)混合，并按照先前的方法提取这土壤悬液，发现使用长链有机酸和氨基酸组合培养的土壤占比在（50%，90%）的处理可以降低发病率，这一结果更加证明了微生物群落在这个过程中的主要作用。

图4. 人工分泌物培养土壤对拟南芥发病率的影响

A. 长链有机酸和氨基酸组合培养土壤显著降低拟南芥发病率，短链有机酸和糖类物质组合及其无菌水处理发病率却高到60%。

B. 将长链有机酸和氨基酸组合培养的土壤悬液灭菌，发现失去了降低发病率的能力。

C. 将长链有机酸和氨基酸组合培养土壤与短链有机酸和糖类培养土壤按照1:9, 5:5, 9:1的体积比进行混合并验证发病率，表明了长链有机酸和氨基酸组土悬液比例越高发病率越低。

D.  将长链有机酸和氨基酸组合培养土壤与短链有机酸和糖类培养土壤灭菌后按照1:9, 5:5, 9:1的体积比进行混合进行发病率评估，发现各组土悬液发病率不显著，均维持在50%左右，表明长链有机酸和氨基酸处理失去了抑病能力。

结论

本研究中我们发现叶际病原菌的入侵植物，会对土壤微生物产生某种影响，这里我们称为土壤记忆，或者土壤遗产。土壤记忆会帮助在相同地点种植的同种后代作物抵御同种病原菌入侵。土壤记忆主要是在连续五季种植拟南芥并在病原菌诱导下形成的土壤细菌群落的作用，这一过程中根系分泌物起着重要作用。换句话说，拟南芥在受到病原菌侵染后，通过改变根系分泌物成分（增加氨基酸和长链有机酸分泌量）调控土壤微生物群落来加强自身抵御病害的能力。

材料方法

病原菌驱动土壤的培育

Development of pathogen-conditioned soils

土壤是2014年7月份采的，美国密歇根附近的一个地方Benton Harbor: N 42°05′34″, W 86°21′19″)。拟南芥在这里自然生长了十几年了。土壤避光运到实验室并保存在4°条件下。正式实验前，土壤在室温状态下被晒干，混匀，去除石子杂草等成分。我们将为其五季培养土壤，所用拟南芥种子首先放置于添加1%的葡萄糖的MS琼脂平板并置于4°条件下两天。随后在光照培养箱中培养 (光照及其温度条件：25 ± 2 °C, 16 h light / 8 h dark, light intensity 45 μmol m s⁻¹）。七天后将拟南芥幼苗转移到108个盆子中，每盆一颗苗。（这里设置两个处理，每个处理18个重复，每个重复3盆）。每盆装土50g，在拟南芥生长14天后一般的盆栽叶接病原菌。操作为使用吸有病原菌注射器刺穿每株苗子的四片真叶，并保留1 μL的病原菌悬液。所用病原菌悬液浓度为10⁷ CFU/mL。与此同时，同样使用注射器相同操作注射无菌水到另一半的盆栽中作为对照。为了菌悬液掉落土壤，等待菌悬液风干之后将所有盆栽随机摆放生长。14天后评估叶片发病区域大小，并去除植株地上部分，将土壤风干一周后，每个盆钵中加入5ml的MS无糖培养基，并且作为下一季的土壤重复第一季的种植和病原菌处理过程。这一过程将一共重复五次。最终我们获到病原菌驱动的土壤。

处理土壤抗病性评估

Assessment of disease resistance on conditioned soils

将生长七天的拟南芥幼苗分别转移到27盆病原菌驱动的土壤和对照土壤，并放置于人工培养箱中培养。在培养14天后按照上文所述方法在叶片上接种病原菌，并在一周后计数叶片坏斑的数量并统计发病率。

微生物样品收集和激素水平的测定

Microbiome sample collection and determination of phytohormone levels in the absence of the pathogen

剩余27盆对照的土壤用于测定拟南芥激素水平和土壤微生物群落。同样将育苗7天的拟南芥转移到这27盆中，每盆一颗，然后正常培养28天后收获，称重并测定植株地上部分激素水平。收集根际土壤，所用方法为：轻轻提出拟南芥根系，并抖干净根系上松散的土壤，紧紧附着在根系上的土壤定义为根际土壤，其次剩下的盆栽中的土壤则定义为土体土壤(bulk soil)，三盆样品混为一个，分别得到9个重复的土体土壤和根际土壤。随后样品立即储存于-80°条件下。植株激素的提取：低温提取剂比例为20:79:1的甲醇，异丙醇和醋酸的混合液。内标使用茉莉酸，水杨酸，脱落酸混合物10微升，并添加到每个样品中。样品提取过程和LC-MS测定流程：使用仪器：AB公司Qtrap6500 质谱仪，此质谱仪的质量分析器为三重四级杆-离子阱模式。采用ESI-HPLC-MS/MS方法对植物激素进行定量分析。LC-MS / MS缓冲液如下：缓冲液A为0.1％甲水溶液和缓冲液B为0.1％甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度：0-1 min，A=20%；1-9 min，A 递增至80%；9-10 min，A=80%；10-10.1 min，A 递
减至20%；10.1-15 min, A=20% Waters
TargetLynx软件用于数据处理和激素的定量。植株激素的定量使用如下公式计算：样品峰面积乘以内标浓度与内标峰面积的比值。

PCR扩增和测序

PCR amplification and sequencing

对18个根际样品和土体样品总DNA进行提取。使用Power Soil DNA Isolation kit (Mo Bio
Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)称取0.5g土壤并按照说明书进行提取。提取好的样品放置-20°保存。PCR之前将技术重复混合，再用于评估DNA质量及其浓度。提取的总DNA浓度测定后范围为40-60ng/μL。使用341F (CCTAYGGGRBGCASCAG) and
806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物对扩增16S rDNA片段。PCA条件为：30 s at 95 °C, 30 s at 59 °C, and
30 s at 72 °C for 30 cycles。PCR体系：9.75 μL 超纯水, 5 μL 5× PCR
缓冲液 5 μL 5× Q5 GC high enhancer, 2 μL deoxynucleoside
triphosphates (dNTPs), 1 μL 每个引物,
0.25 μL and 5 U/μL of Q5 酶, and 1 μL of
extracted DNA。之后跑胶，纯化扩增片段。在密歇根州立大学的基因中心做测序，使用Illumina MiSeq 测序平台的 PE250 模式进行双端测序。经过双端俣并，得到16S rRNA gene的V3-V4区域大约480bp长度的片段序列。

数据处理过程和下游分析

Amplicon sequence processing and analysis

使用Qiime2进行序列处理，当时还是测试版本(version 2017.12, https://qiime2.org/)。序列质量评估使用‘Demux’命令。由于测序片段长度跨度过大，并且在3端测序质量不好的情况下我们进行双端序列拼接只能得到较少的有效序列，或者增加容错率，但是拼接序列可信度下降。最终使用的包含V3区域的forword测序片段进行单端分析（我想大家应该可以理解，虽然V4区域多样性更高，但是在测序平台进行后端序列测定时往往质量低于前端序列的质量，追求准确就要牺牲一点多样性）。使用DADA2流程：序列左端裁剪17个bp全序列保留到140bp的长度，也就是说大约120bp的序列参与分析，并且基于这些序列得到高质量的actual sequence variants (ASVs)。最终的ASV表格包含135万条序列，并得到大约5000个ASVs。分析过程中我会观察到这样的现象：有一些ASV在一个样品中出奇的高，但是在其余样品中却几乎没有，这很有可能是嵌合体？/天然序列变异的偶然事件？在进行下游分析时过滤掉了这些ASV。最终ASV表格中包含90万条高质量非嵌合体序列，大约2000个ASV。物种注释使用的是Qiime2中的vsearch分类器，数据库使用的是SILVA 16S rRNA数据库。数据下游分析使用Qiime2环境和R语言。Beta多样性的计算使用phyloseq包。显著性分析使用的ANOSIM方法。出图使用R包ggplot2。以上代码可用，参见附件。

使用PCR检测土壤中病原菌Pst

Pst detection in soil by PCR

使用引物对OWB575 (AACTGAAAAACACCTTGGGC)
and OWB576 (CCTGGGTTGTTGAAGTGGTA)扩增病原菌Pst。PCR条件和体系：见原文。使用超纯水作为阴性对照。DC3000的基因组DNA作为阳性对照。PCR产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳跑胶检测。

土壤化学性质的测定

Soil chemical analyses

当第六季拟南芥生长结束之后，收集土壤5g用于测定土壤化学性质。测定指标包括：速效磷，有效钾，铵态氮，硝态氮和pH。所有指标完成于科罗拉多州立大学实验室。

根系分泌物收集和GC-MS测定

Root exudate collection and GC-MS analysis

使用相同方式育苗，并培养14天后按照之前交代的方式叶部接种病原菌，同时使用无菌水接种叶部作为对照。等待叶部风干之后将拟南芥放置于含有灭菌的水琼脂培养基（半固体）的六孔板中收集分析分泌物。三天后收集水琼脂培养基，并将所有样品混为一个样品，至于冷冻干燥机中冻干等待下一步分析。将冻干粉末送公司测定。

根系分泌物影响土壤微生物群落并反馈增强植物抗病性

Impacts of root exudate classes on soil microbiome feedbacks to plant defense

为了检测叶部侵染病原菌后植株分泌根系分泌物对土壤抗性的影响，我们选择了四种不同类别的根系分泌物，分别为：氨基酸类，长链有机酸类，短链有机酸类，糖类。每种类别的分泌物成分选自病原菌入侵后分泌量发生变化的分泌物。长链有机酸类物质的配置：2微摩尔的十五烷酸，棕榈油酸，十六烷酸，十八酸，花生酸等体积混合，最终浓度为10微摩尔。其余三种类别的物质均为六种同类物质等浓度混合，最终浓度为10毫摩尔，是长链有机酸的十倍，因为长链有机酸在根系分泌物中的含量要低于这三类物质。氨基酸类物质包含：异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，色氨酸，鸟氨酸；短链有机酸包含：柠檬酸，乌头酸，琥珀酸，苹果酸，酮戊二酸，丙酮酸；糖类物质包括：麦芽糖，核糖，葡萄糖，蔗糖，果糖，木糖。

使用六孔板，并在每个孔中添加15g土壤，30°恒温预培养一周来活化土壤微生物并去除发芽的幼苗。设置一下三个处理：长链有机酸和氨基酸等体积混合用来模拟病原菌感染后的根系分泌物变化；短链有机酸和糖类物质混合，代表对照植株分泌物模式；使用无菌去离子水作为对照。每个处理做18个重复，也就是三块六孔板。将配制好的溶液或者无菌水按照每个孔1.5ml的量添加，每周添加两次，放置于30°恒温培养。一共添加了八周，也就是17次。

为了验证模拟分泌物添加对土壤抗病性的影响，使用土壤悬液和无菌土壤悬液，制作方法为：将培养过的土壤按照十分之一的土水比获得土壤悬液。悬液使用普通定性滤纸过滤，随后通过0.22微米水洗滤膜为无菌的土壤悬液。长链有机酸和氨基酸组的土壤悬液同短链有机酸和糖类组的悬液按照9:1, 5:5, 1:9这三个体积比混合，用水培养过的土壤悬液为对照，添加到体积比为1:1的灭菌蛭石和石英砂中，按照上文标准提前育好的拟南芥种植于混合并添加好溶液的基质上，补充添加MS无糖液体培养基。培养两周后按照上文提到的方法接种病原菌并在7天后测定发病率。

统计方法

Statistical methods

发病率，生物量，激素，混合根系分泌物差异，土壤化学性质在SPSS软件使用t检验做差异分析，并设置显著性阈值为0.05。微生物群落和根系分泌物整体差异使用置换检验（在R 3.4运行）。特定微生物及病原菌丰度差异使用Deseq2包完成，显著性阈值设定为（0.05）BH方法矫正p值。

参考文献

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-018-0537-x

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