还是关于植物病毒相关载体和农杆菌介导转染的内容。

        先爬到山上，俯视一下整个基因工程中用的载体，动物中常用一些病毒载体，转座子相关的载体等，植物常用的为农杆菌介导的双元载体，当然还一些其他的类型。

        为什么不一样呢？其实也不难理解，这些载体其实算是一些衍生物。在研究不同物种的各种现象中，清晰的解析了一些机制后，开始尝试改进应用于实验中，或者实际生产中。比如农杆菌可以介导T-DNA转移并稳定的插在植物基因组中，于是开始应用于基因工程，但是动物中就不可以，首先农杆菌就不能感染动物细胞，但是病毒可以啊，例如慢病毒，来源于HIV，逆转录的RNA病毒，可以实现将外源DNA片段转到动物基因组上。然后更进一步的话，在不同物种之间还是有差别的，比如农杆菌比较容易侵染双子叶植物，但是单子叶比较难一些，因为损伤后一些能刺激农杆菌的酚类物质的缺乏。所以这也给其他载体的产生留了一些空间。

       在植物中，其中一个关注度比较高的是病毒载体，类似动物病毒载体。植物病毒载体多用于瞬转，其中有个原因是有些RNA病毒在胞质里复制，根本没进去核，，有些DNA病毒例如双生病毒，要入核的，可人家环状的，借点东西自己就完成复制了，，还没看到像慢病毒那样反转录病毒，可以整合到基因组上，当然也是失去复制能力的改造后的。

       既然瞬转，那就差不多两个方向，一个是用来表达蛋白，另一个相反方向的就是沉默基因。DONSON et al.,1991应该是第一次实现外源基因用病毒载体进行表达。然后就是1995年，一个 phytoene desaturase（有道翻译为八氢番茄红素脱氢酶），一个在类胡萝卜素代谢途径中起作用的酶，其反向基因片段被转插入到病毒载体中，然后再接种到烟草中（当年的文章真的好难读，实验不多，但是方法不打同，表达方式也有些差别，心疼的抱住胖胖的自己，，，），发现这个基因功能被抑制了（KUMAGAI et al.,1995)，然后开启了VIGS(virus-induced gene silencing)之路，，，

      补充一点，其实也在同一年，Baulcombe 实验室也发现了类似的基因沉默，（没错，就是那个被很多做植物的人扼腕没有拿诺奖的人，毕竟做植物的也贡献了不少基因沉默的机制），他们实验室发现PVX这个病毒的RNA聚合酶转到烟草中，再次接种这个病毒的时候，有抗性了。然后发现这个同源的可以实现基因沉默。

       当年那群年轻人，现在的那些大牛应该尝试过很多种病毒表达载体，但是现在基本很少用这些载体再表达蛋白，有一个主流原因就是插入的片段大小太限制，个人觉得还有不太好操作。一般情况我们会在同一片叶子或者同一植株上表达实验组和对照组，尽管病毒复制会带来很高的表达效率，但是这病毒顺着维管束、胞间连丝到处跑，就没办法来判断实验结果了。如果放在不同的苗子上，那差别还是不小的，谁用谁知道。其实通过现在做VIGS的protocol就知道，需要单独拿苗子沉默一个无关基因，来显示沉默的强度与位置。

       个人觉得现在用的最多的病毒载体还是VIGS相关的，优势是可以实现大规模甚至整株苗子的基因沉默，虽然现在CRISPR可以实现顶点敲基因，而且一次还可以敲几个，但挡不住同源家族好多基因一起形成的冗余，所以这时VIGS的高效立竿见影。但当然也要注意使用的载体，一个病毒不是能感染所有物种的。

       但是，还有很多人没放弃开发病毒载体，这时候或许已经不能再称之为病毒载体了。是一种融合的版本，像我们经常用到的35S启动子，就是来自烟草花叶病毒的，但是已经把它转移到农杆菌的双元载体上了。如pEAQ系列的载体，取的是CPMV里一段5‘UTR 和3’UTR，放在了农杆菌双元载体上，用于增强瞬时表达，当然他们做的还是认真的，放了沉默抑制因子P19系列的，各种Tag的系列，遇到表达困难的时候，也是值得一试的。具体见Sainsbury et al.,2008 和 Sainsbury et al.,2009. (哈哈，没错，就是同一个Sainsbury，在Sainsbury laboratory 对面John Innes Centre的Sainsbury,个人觉得这孩子估计在John Innes Centre也肯定被开了不少玩笑）

Reference

1. DONSON et al,1991.Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector.Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 88, pp. 7204-7208

2. Mueller E, Gilbert J, Davenport G, Brigneti G, Baulcombe DC: Homology-dependent resistance: transgenic virus resistance in plants related to homology-dependent gene silencing. Plant J 1995, 7:1001-1013.

3. KUMAGAI et al,1995.Cytoplasmic inhibition of carotenoid biosynthesis with virus-derived RNA.Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp. 1679-1683,

4. Sainsbury, F. and Lomonossoff, G.P. (2008) Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiol. 148, 1212–1218.

5. Sainsbury et al.2009.pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.Plant Biotechnology Journal  7, pp. 682–693