写在前面的话，，，，盼望着，盼望着，假期终于快要来了！！在自己的争取之下，把寒暑假一块修了，对于一个月的假期很是期待呢。来，划重点，终于有时间可以把做的相关的实验的背景整理整理了，很是兴奋。最重要的是，我又要重获自由身了！哎，前段时间真的太苦了。不仅要自己上报每周工作进度，还要被算工作时间，每周五天，每天八小时，不行，要996，而且还不算看文章的时间。而且，还有各种不知名的人monitor着你。有段时间每天都会崩一次，然后第二天早晨再把破碎的心拼起来。有时候早晨直接丧掉了。还好，马上就可以毕业了！马上哒！想想就很开心。以后如果遇到这种老板，马上的，拎包走人。谁让我签了卖身契的，中途退学要赔钱的。现在啊，对于这种给工资的地方，都长了个心眼，先问问不行可以走人吗。谁让俺天生爱自由呢，选择这行最大的好处不就是自由嘛。

      言归正传，本来以为做的是个小课题，没想到后面是生化遗传都做了。做了一圈下来，发现最靠谱的还是遗传学实验，童叟无欺啊。实验过程很简单，做个转化或者杂交就行了。结果呢，也有目标性，是就是，不是就是不是，顶多做一下统计。但生化实验就不一样了，哪样东西稍微动一下，就一个实验结果，或者时间动一下，就又有一个结果。比如说，BiFC,用来验证互作的，不同的烟草苗子有不同的结果，即使是同一棵苗子，同一个菌，新叶子老叶子也有不同的结果。在假阳性这么高的情况下，negative control稍微表达不好，就会以为control没有信号。所以说没有western blot的任何BiFC结果都是在耍流氓。

      FRET-FLIM，确切的说我做的FLIM，荧光寿命成像。使用的荧光蛋白是GFP和RFP,GFP的发射光谱和RFP 的激发光谱有一部分重叠，当一束激发光打到GFP上之后，GFP会由激发态回到基态,会释放一定的光子，产生荧光，而此时，如果RFP距离非常接近，其震动能级非常相似，然后就像共振那样，RFP 会被激活，而这时GFP 的能量部分会被转移给RFP,这样它用于释放荧光的能量会减少，这样看到的就是荧光发光时间的减短，就是荧光寿命的减短。而且不止这一种能量散失的方式，还有其他的因素也会影响其能级的跃迁，荧光的发射，比如周围的微环境，PH等等。所以其很灵敏，有时候也会是一种负担。（听起来像是长得帅也是一种负担呢）通常选用基因-GFP 作为negative control，而你加入另一个链接基因蛋白的RFP 所造成的环境变化就会被忽略。我使用的free RFP 做为negative control，按道理应该和只有基因-GFP的没什么变化，但是其荧光寿命也会降。而且不同重复间还有些不同。而且还跟蛋白表达量有关。而且基因是瞬转的，很多也不是烟草的基因，这本来就不是一个很稳定的环境，可能会造成些波动。所以呢，个人觉得任何荧光寿命降低的少的互作，也是在耍流氓。

     最近在做luciferase activity assay(实在不知道中文名，，）,即将荧光素酶连在一个想要检查的promoter后面，如果检查的转录因子可以结合上去。则可以启动表达出荧光素酶，这个酶遇到底物之后就会发出荧光。我的实验目的是检测一个转录因子结合之后是否会抑制表达，发现同一个样品前三分钟拍的和后三分钟拍的居然能得出不同的结论，，信号强度会变。而且刚刚才意识到，我这种对比的需要量化，然而，我却没有在载体上加内参，，虽然我接手的时候已经在用这个载体了，，我为什么没有再认真检查一遍，，等我做完这个实验再加续集吧，未完待续，，等我回来骂流氓哈，，