鄙人最近因实验需要做了一回冷冻切片，发现网上相关介绍凌乱，特将个人整理的资料记录于此。

一、冷冻切片机

       首先是冷冻切片机，我们使用的是LEICA CM1850，其调节按钮主要分布在前方与左侧，如图1。上方调节按钮从左向右依次为：

•  第一个调节框是快速冷冻调节，按下后冷冻室将会快速冷冻十分钟，显示频会显示快速冷冻倒计时。

• 第二个调节框可调节操作台温度，即切片位置的温度。

• 第三个调节框是用来调节时间的，显示频下方带有钟标志的可以调节时钟，右侧除霜标志处可以调节自动除霜时间，24小时循环一次。

• 最后一个调节框，左上方除霜标志可立即进行冷冻室手动除霜；右上角灯泡标志可以将冷冻室照明打开；下方钥匙标志用于锁定和解锁控制面板，按下将无法修改设定好的值。

       左侧按钮为将样品安装到样品头上之后，可以调节样品与刀片之间的距离。双箭头为快速，单箭头为慢速。

        LEICA CM1850冷冻切片机具体介绍及注意事项详见https://wenku.baidu.com/view/c20b4d5bbf23482fb4daa58da0116c175f0e1e85.html。

图1 LEICA CM1850冷冻切片机外观

二、样品处理

       物种和处理部位都会导致含水量不同、软硬程度不同，就会使得对样品的处理方式不同。例如我处理的材料为甜高粱萌发种子的胚芽，在试用过使用50%的酒精和FAA固定液固定后，发现不使用任何固定剂，直接用新鲜材料做冷冻切片效果最好。所以在做冷冻切片前，最好先查文献是否有人曾经和你做过相同物种相同部位的切片，如果有，大可按照其处理的方式进行；如果没有，则需要根据其软硬程度来调节固定剂中某些药品的浓度。如固定剂使用FAA，较硬的组织如叶片需要试用70%的酒精来配置FAA，较软的根最好试用50%的酒精，当然，具体的浓度还需要再进行调试，而且利用甘油填充时浓度也不同；如果直接利用酒精来固定，直接调节其浓度就可以。

1.材料的固定

       取约0.3cm $\times$ 0.3cm $\times$ 0.3cm的组织块（长宽高可以小些，但不可大过0.5cm)，放入50%酒精（可根据材料进行调节）中固定3h，也可放在FAA(100mlFAA=89ml50%酒精+6ml冰醋酸+5ml福尔马林)长时间处理，但时间过长会使其中某些成分散失，一般过夜处理。

2.前处理

（1）将固定好的材料转入盛有甘油的小瓶，根茎部位采用15%浓度的甘油浸泡，叶片叶柄采用10%甘油浸泡，置于玻璃真空干燥器中使用旋片式真空泵抽气20min，使材料空腔完全被甘油填充。

（2）取出放在20℃培养箱中放3h。

3.样品固定至标本盘

（1）取少量包埋剂OCT放在标本盘上做成高约0.3cm、直径约1cm的圆柱来做底座，冷冻完成后，放在样品头，拧紧螺丝，厚度可调至40-50um，将上面做成一个平面。

（2）将样品放在底座上，如果是需要细长的材料如根的横切面，可将底座上扎个洞，将样品立于其中，再用OCT将样品完全包埋。放在冷冻室直至完全冷冻。

4.切片

   冷冻完成后，将其侧面削成梯形，固定在样品头上，开始可将切片厚度调高些，将上面空白无样品的包埋剂部分除去，切至材料时，将厚度调为约15um，顺时针转动手轮进行切片。

5.展片

将载玻片拿进操作台，打开放卷板，靠近切片，由于玻片温度较高，切片自动吸附到玻片上，取出后，添加少许蒸馏水可将切片展开，盖上盖玻片可进行观察。

6.染色

  向展开的材料滴加1%番红染色20min，然后用蒸馏水洗涤3-5次，可再次进行观察。

7.观察

  使用带CCD拍摄系统的显微镜进行观察并记录。

部分步骤摘自植物冷冻切片http://www.docin.com/p-200521140.html。