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胚胎期13.5小鼠生殖脊(全组织)的免疫荧光标记

已有 2602 次阅读 2018-10-23 11:55 |个人分类:实验技术|系统分类:科研笔记| 生殖脊, 免疫荧光标记

 

胚胎期13.5小鼠生殖脊全组织的免疫荧光标记

 

实验目的对生殖脊卵母细胞的免疫荧光标记全组织染色),EdU标记如只标记抗体可免去EdU相关步骤

 

试剂耗材

          (1)固定液:4%多聚甲醛,-20/-80冻存长期或四度保存一个月)。

          (2)透膜液:PBS+0.1% 吐温+0.1% Triton X-100,过滤,4度或室温保存

          (3)封闭液:PBS+0.1% 吐温+1%BSA,过滤四度保存

          (4)洗液:PBS+0.1% 吐温过滤,4度或室温保存

          (5)封片剂各类商业封片剂

          (6)抗体一抗和二抗都用封闭液稀释

          (7)DNA染料:Hoechst33342。

          (8)指甲油

          (9)载玻片/盖玻片

          (10)湿盒暗盒加水

          (11)碧云天EdU click试剂盒

 

实验样品孕鼠(13.5dpc,11.5-17.5皆可,11.5之前的生殖脊分离较为困难但也可用此法)。

 

实验步骤

          (1)EdU培养液培养生殖脊

               用细胞培养液比如DMEM高糖+10%FBS+PS)配制10μMEdU。加入24孔板的孔中备用每孔200μL即可)。

               生殖脊的分离取孕鼠分离胎鼠分离生殖脊减掉多余组织

               将生殖脊在EdU培养液中培养4h。

               

          (2)固定取出生殖脊24孔板的孔中固定200μL4%多聚甲醛可以直接在原来的孔中固定),室温1h。

          (3)透膜吸出甲醛,PBS2-3可省略),0.3%Triton,室温2小时PBS清洗3-5每次5min。

 

          (4)按说明配制EdU click反应液事先分装好)。

 

          (5)将生殖脊夹到载玻片上用盖玻片尽力压扁揭掉盖玻片在组织周围用蜡笔或组化笔画圈加入EdU click反应液如果组织黏到盖玻片上就在盖玻片上做下面的步骤

          (6)湿盒避光用洗液清洗3加入封闭液室温1-2小时或四度过夜)。一抗孵育用封闭液稀释一抗去除封闭液加一抗孵育时间1-2至少四度过夜),洗液清洗3-5

          (7)二抗孵育用封闭液稀释二抗湿盒避光室温多于2小时洗液清洗3-5

          (8)Hoechst染核大约1μg/mL为工作浓度可进一步用洗液稀释室温处理卵1-2h。

          (9)封片点加封片剂盖上盖玻片用指甲油封住

          (10)在载玻片上标记实验内容日期

 

           不同种属的一抗可以混在一起孵育细胞但是某些抗体不适合同时进行染色比如Rad51γH2A.X,此两者的抗体应该有竞争关系有相关文献可查

 

问题分析

          (1) 




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