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卵母细胞和早期胚胎S期及DNA复制之检测
实验目的:对卵母细胞的DNA复制和早期胚胎的S期的鉴定。
试剂耗材:
(1)固定液:4%多聚甲醛;
(2)PBS,4度保存,备用。
(3)PBS+3%BSA,是为洗液。
(4)PBS+0.3%Triton,是为透膜液。
(5)BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒。
(6)封闭液:PBS+0.1% 吐温+1%BSA,过滤,四度保存。
(7)洗液:PBS+0.1% 吐温,过滤,4度或室温保存。透膜液(PBS+0.1% 吐温+0.1%曲拉通)。
(8)封片剂。
(9)抗体:略。
(10)DNA染料:Hoechst33342,Hoechst33258,PI,DAPI。
(11)羊毛脂:不可用指甲油。(16)载玻片/盖玻片。(17)湿盒:暗盒加水。
(12)培养皿/口吸管/台式显微镜等
实验样品:小鼠/人的裸卵或早期胚胎等(以裸卵为例)。
实验步骤:
(1)将EdU用培养液稀释为10μM,分装,-20度保存。
(2)将卵母细胞实验组,对照组在EdU培养液中处理2h-3h。
(3)固定:4%多聚甲醛室温固定裸卵15分钟。
(4)透膜,室温15分钟。
(5)PBS+3%BSA洗液,清洗3次,每次5分钟。
(6)在步骤(5)时,配制反应缓冲液。按碧云天试剂说明书配制,其中某些试剂可以分装。每次只需配制200微升,或者更少体积。
(7)将(5)之裸卵放入(6)之反应液中,室温1小时。
(8)洗液洗三次,染核。(如果想标记抗体,则在清洗三次后,封闭,孵育一抗,略)
(9)封片。
问题分析:
(1)此方法是检验细胞所处细胞周期阶段的快捷办法?
(2)卵母细胞中的DNA复制?
(3)卵丘细胞中的DNA复制?
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GMT+8, 2024-9-23 15:29
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