土鳖博士如何把Cas9玩出变形金刚的感觉？

一稿难投三波折，砥砺吾心炼坚强！

傍晚，文章online了，曾经幻想过无数次这一时刻，觉得文章online后应该好好休息一下，去爬爬山看看景，或者去风景区看看人海，至少也得去中关村吃一顿好吃的，可真的online后，似乎觉得这件事情已经过去了很久，一如往常做完实验，赶在食堂关门之前，饱饱的吃上一顿，迎接晚上的实验，走在回去的路上，忽然觉得进到这个校园竟然都三年了，三年前自己穿个拖鞋，背个书包就跑到北京，说要来找实验室，找学校准备保研，这一切仿佛还都在昨天，没想到一眨眼，三年就过去了。

三年足够一个初中生走向高中。

三年足够一个硕士毕业。

三年很长，三年里，我究竟学到了什么？难道所有的奋斗，真的只是为了paper上的一个名字？

下一个三年我该怎么去奋斗？！

今天online的这个工作，持续了接近两年，忽然想从头到尾把整个心路历程记下来。

真正说起这个故事，还是得从三年前那个那个穿拖鞋的我说起，那个时候自己还是大四，刚刚被清华合成与系统生物学中心录取攻博，合成生物学？什么是合成生物学？这个领域究竟是什么样一个情况？既没有做过iGEM（国际遗传学大赛，很多后来在合成生物学领域有所突破的博士，都有着本科iGEM的背景），其实也没有读过几篇文献。

既然都要读博士了，我怎么入手这个领域？

对于一个大四的牛犊来说，也许那个时候，评点一篇CNS的文章就好像如果自己是第一作者分分钟就能做完一样，天不怕地不怕，可能所有新手都有这样一个不切实际的想法，尽快的读完这个领域很多文献。

在川大的望江校区，打印店遍地都是，又都很便宜，自己在pubmed上开始检索起”synthetic biology“，下了不知道多少篇文献，竟然整整打印了四大本，从成都一路读到了北京，我的故事和大多数人一样，也许就前几页读了，后面可能都找不到书了。

是的，虽然我累的满头是汗，把这四大本驼到北京，事实上，自己就是那么好高骛远，也没有读几页。

虽然没有读几页，但是大概还是有了一定的印象，原来合成生物学的很多是生物元件系统的开发，利用不同元件的特性，通过一定合理的设计来实现相应的功能。

其中有一个工作［1］还是稍微有了些印象，讲的是什么样一个故事哪？

这篇文章是合成生物学领域的大牛Pamela Silver发表在Nuclear Acid Research上，

说是，利用一种叫做intein（内含肽）的工具，将另外一种可以定制化结合DNA的蛋白叫做TALE给拆开了，拆开后，这样就可以做多个输入。

之所以对这篇文章看着亲切一些，一来是对内含肽比较熟悉，为什么哪？自己大三时候，突然想学学药学院的课，就选修了一些，其中有一门考试有一个名词解释：intein，看着这个单词，第一次见，跟intron比较像，但是后缀又好像蛋白protein的后缀，自己就没敢写，记了下来，然后回来一查，果然是一种蛋白，可以像intron（内含子）发生自剪切。

                          图1   内含肽使用范例［2］

正如图中两个绿色的部分，内含肽的N端和C端，其中他们可以跟intron一样，发生自剪切，这样就会将两边的蛋白给连接起来。

另外一个比较熟悉的东西是TALE，这个东西很神奇，第一次接触是大三的时候，全国的生物化学与分子生物学年会在成都开，自己偷偷的进去旁听过，其中颜宁的学生邓东，就在报告他们解析了TALE的结构［3］，TALE蛋白中间是由一串重复性单元组成，其中每一个重复性单元由两个helix组成，在helix中间的两个氨基酸特异性的识别某个特异的碱基对。然后不同的重复单元识别不同的碱基对，这样就可以定制化的特异性识别某个特异的DNA序列，通过定制化特异的DNA序列，人们可以特异的结合到某个基因组到位置，比如打开某一个基因的表达，或者对某个位置进行切割。

                          图2  TALE 的结构［3］

                          图3  TALE进行基因组切割的模式图［4］

Nuclear Acid Research这篇文章主要是讲，利用intein将TALE蛋白人为的进行拆分，拆分后，就可以变成两个蛋白，而这两个蛋白当遇到的时候，就可以自剪切，从而形成完整的整体，这样就可以实现一个“与门”的逻辑运算。

                         图4   利用内含肽对TALE进行拆分［1］

当大四时候，读到这篇文章，也并未觉得自己可以利用，虽然当时候，Cas9已经横空出世，各种不同的生物元件在TALE上被证明有效后，就紧接着被转移到Cas9上来，自然一个非常朴素的想法就是intein估计也可以用来拆分cas9，既然一个很简单的想法，自己为什么要follow这样一个idea哪？

就这样，这篇文章，随着尘封的四大本paper，被我遗忘了。

时间就是这样翻过一天又一天。大约一年后，那个时候，我已经正式入学，有一天组会上，导师谢震老师，突然问我们，如果将Cas9应用在生物遗传病的治疗上，你们觉得障碍是什么？

Off－target问题！蛋白太大，无法放到目前被认为比较安全的腺相关病毒载体中！

“那么你们可以想想办法解决吗？”谢老师说道。

“也许我们可以利用内含肽将cas9拆开，这样就可以放到两个载体里面！”我应声答道，“曾经有一篇silver的文章，就是利用intein将TALE拆开”，我突然想到曾经看到的这篇文章，回答道。

从会议室走回实验室的路上，谢老师突然叫住我，“大程，你也许可以试一试，至少这样就可以通过腺相关病毒递送cas9了！”。

获得导师的首肯后，我开始着手设计，正如silver NAR那篇文章中所说，将intein放在蛋白较为柔和的区域［3］，我选择了713，开始了第一个实验。

那个时候，刚刚入学，构建质粒还不是那么顺手，摇摇晃晃，总算把构建出来的质粒做出来了。非常不熟练的做了次转染，细胞死的差不多了，但是还活着的细胞竟然展现出可以被切割的活性？

难道说我真的做出来了？

第二天和导师汇报工作，谢震老师也非常激动，他勉励我，继续测试不同的位点，是否可以在不同的位置有类似的结果。

紧接着师弟彭曙光加入这个project中来，我们一起测试不同位点的切割结果。

时间过的很快，转眼就要到了春节，整整做了一夜实验的我，终于在回家前做好了不同拆分位点，用于切割，转录激活，转录抑制的相关结果，腊月28，踏上了回家的火车。

                  图5  将cas9进行拆分后激活基因

事情并不像想象的那么顺利，刚过完春节，忽然看到邮箱里一则pubmed的推送，大名鼎鼎的Zhang Feng，发表了题为：“A Split Cas9 Architecture for Inducible Genome Editing andTranscription Modulation”的工作，这不正是我们想做的吗？

                        图6 可以诱导的拆分cas9［5］

刚刚尝试的我，遇到了第一个打击，其实，这还只是开始。

谢老师勉励我们，既然Zhang Lab采取了直接拆分的方法，还是和我们有所不同，是否可以对两者进行比较？

又过了三个月，我们又完成了相应的比较。除了两段拆分，那么我们是否可以进行三段拆分？

既然我们可以使用intein和直接拆分这两种方法，而且有四个不同的位点，那么是否我们可以一个位点使用intein，另外一个位点直接拆分，这样就可以把cas9拆成三个部分？

                  图7    将dcas9拆成三段

除此之外，既然对于拆分cas9，已有报道，那么是否我们可以利用合成生物学工具，使用基因线路进行优化？

几个月前，课题组刚刚在Nature Chemical Biology 上发表关于使用互抑制子基因线路对细胞进行分类的工作。那么，我们是否继承实验室其他人的基础，应用在我们的工作上？

                        图8 基于TALE互抑制感知shRNA信号［6］

说干就干！

课题组的这份工作是通过感知shRNA信号，控制不同的细胞中表达不同的荧光蛋白。那么是否我们可以控制不同的细胞表达偶联不同效应蛋白结构的C端？

                    图9  基于TALE互抑制 控制dcas9蛋白交换

就在我们第二次决定投稿的时候，没想到第二个打击就来了。

Pubmed再一次推送了一篇发表在Nuclear Acid Research上的文章，相继在scientific report也有一个关于使用intein的文章，我们intein的希望了也落空了！！

当晚导师谢震打来电话，安慰我说，“大程，不要灰心！我们可以继续完善交换cas9结构域的工作”

图10  不同的变形金刚（取自网络）

                    图11   不同的小车比喻不同的cas9，在不同的信号下采取不同的另外一端，实现不同的功能。

Cas9如果未来应用于医疗等应用，对Cas9实现精确的控制是必须的，那么就需要哦实现在特定细胞，表达cas9，甚至于在不同的细胞中表达不同的Cas9！

就好像变形金刚，需要cas9，在不同的环境中，具备处理不同事情的能力！

在连续两次被别人先发表后，终于在今年的春节前进行了第一次投稿！

经过8个月漫长的修改，终于在8月底得到了接受的喜讯！

一稿难投三波折，砥砺吾心炼坚强！

回顾这三年，自己从一个邋遢鬼，变的更加注重细节。

回顾这三年，自己从一个拖延症晚期，变的更加高效。

回顾这三年，自己从急功近利变的更加平静淡然。

回顾这三年，既没有像颜宁施一公的弟子们那样，一年级，二年级甚至本科就可以发CNS那样的成绩，也没有做出多么厉害的工作，只是一步一步的，在艰难中不断的改变那个“乱七八糟”的自己，在失败中始终不放弃前进的希望，不知道自己未来在科学世界走多远，不想去想什么时候是第二篇paper，只想脚踏实地，每天在失望中寻找希望！

感谢我的导师谢震教授！我人生中第一个paper合伙人－彭曙光！

马大程  于实验台前

16.10.3

文章链接：

http://www.nature.com/ncomms/2016/161003/ncomms13056/full/ncomms13056.html

参考文献：

［1］Lienert F, Torella J P,Chen J H, et al. Two-and three-input TALE-based AND logic computation inembryonic stem cells[J]. Nucleic acids research, 2013, 41(21): 9967-9975

［2］http://www.contoo.de/en_US/congress/paper/id/1569/c_cult/en_US/lyt/c.html

［3］Deng D, Yan C, Pan X, etal. Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TALeffectors[J]. Science, 2012, 335(6069): 720-723.

［4］http://labomics.com/media/wysiwyg/Illustration-of-TALEN-design.jpg

［5］Zetsche B, Volz S E, ZhangF.  A split Cas9 architecture for inducible genome editing and transcriptionmodulation[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(2): 139-142.

［6YinqingLi#, Yun Jiang#, He Chen#, Weixi Liao, Zhihua Li, Ron Weiss* and Zhen Xie*.Modular construction of synthetic circuits using TALE transcriptionalrepressors in mammalian cells. Nature Chemical Biology 11(3):207-13.

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