摘要

花青素决定了植物的花、水果和紫色蔬菜的颜色，也是重要的抗氧化剂，可促进人体健康抵抗衰老。BT 126是代表性的花青素含量较高的西兰花品种(5.72 mg/g FW)。为了定位花青素合成相关数量性状座位（QTLs），本研究在BT126和不含花青素的品种SN60杂交的F2代分离群体，筛选了紫色和绿色各30个极端分离单株，开展QTLseq混池测序，发掘了约1,117,709个单核苷酸多态性（Single Nucleotide polymorphisms, SNP），在7号染色体和9号染色体分别定位了1个主效QTL位点与花青素含量显著相关。为进一步验证该结果，本研究在两个F2群体和F3群体利用多重PCR扩增建库&高通量测序SNP分型技术（Hi-SNP）分型，将9号染色体的QTL区间缩小到了73kb的染色体区间，包含14个候选基因，其中Bo9g174880、Bo9g174890和Bo9g174900是拟南芥的类黄酮3'羟化酶编码基因（花青素合成途径关键基因）的同源基因，将该主效QTL命名为BoPur9.1，候选基因BoF3'H在BT126中的表达量远高于SN60。本研究定位的这些花青素合成相关的分子标记，为西兰花分子标记辅助育种、培育改善外观和保健功效的西兰花新品种提供了潜在的分子标记。

2、材料和方法

2.1材料

本研究以自交系BT126（紫色花球）和SN60（绿色花球）为亲本。为了培养花青素生物合成的分离群体，将紫色头状植物BT 126与绿色头状植物SN 60杂交、自交，构建了2个F2分离群体和1个F3群体。分离群体的个体颜色可以划分为5个等级（图1）。

2.2 QTL-Seq分析

应用QTL-seq 方法，对父母本及2个极端表型混池构建文库测序，并基于SNP index和Δ（SNP  index）估计，确定了包含参与西兰花花青素生物合成的主效 QTL 区间及Candidate SNPs。

2.3Intra-Specific分离群体验证

为了验证QTL-seq 定位的QTLs，通过选择主效QTL区间内的26个SNPs，利用多重PCR扩增建库&二代高通量测序技术（Hi-SNP分型），在两个F2群体和1个F3群体进行SNP基因分型和传统QTL定位。

2.4候选基因分析

在主效QTL区间，本研究利用基因组信息对目标区间内的序列进行了基因注释，克隆测序，并设计荧光定量PCR引物进行表达模式分析，进一步筛选QTL区间内潜在的功能基因。

3、主要结果

3.1 QTL-Seq分析

父本、母本以及两个混池文库的高通量全基因组重测序，每个样本产生158.49-261.57百万条reads，比对基因组共发现了1,117,709 个SNP位点。

3.2Hi-SNP 验证花青素生物合成 QTLs

 为了验证 QTL-seq 定位的BoPur7.1 和 BoPur9.1，本研究在两个F2分离群体对26个 candidate SNPs进行了Hi-SNP基因分型，并与表型数据结合，进行传统QTL定位验证。结果发现定位到两个紫色QTL BoPur9.1（标记区间BoSNP37-BoSNP38，LOD=13.1，PVE=28.19%）和BoPur7.1（标记区间BoSNP1-BoSNP2,LOD=14.6,PVE=38.12%）。其中，BoPur9.1位于第9号染色体，区间缩小到了0.72cM，对应物理区间为72,863bp。本研究还利用F3群体进行Hi-SNP分型，进一步验证BoPur9.1的表型效应。结果表明，标记区间SNP22-SNP23检测到与西兰花颜色相关，该区间位于主效QTLBoPur9.1内部，验证了前期QTL定位的结果。

3.3候选基因的预测与分析

基于 B. oleracea 基因组数据库 (TO1000) ，在两个主效QTL区间内共发现 3 个花青素相关基因和 14 个预测的蛋白编码基因。通过基因注释、表达分析和克隆测序，分析了3个基因表达模式和基因结构及其在亲本材料和分离群体中的序列变异。3个候选基因BoF3’H、BoANS2 和 BoLED38在花青素积累的3个发育阶段表达量显著上调，并且在BT126中的表达水平显著高于SN60（图4B-F）。

4、结论
  

  通过上述发现表明，结合 QTL-seq、Hi-SNP 基因分型验证和基因表达分析有助于在西兰花中鉴定主效QTL 操纵花青素生物合成的候选基因。Bo9g174880、Bo9g174890 和Bo9g174900 是主效QTLBoPur9.1区间内潜在候选基因。本研究在两个 QTL 的置信区间内确定了候选基因，后续其功能的验证将为解析西兰花花青素生物合成的详细机制提供新的见解。

本研究的Hi-SNP高通量基因分型工作由上海翼和应用生物技术有限公司完成。

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