@袋鼠通讯分享 http://blog.sciencenet.cn/u/nowherepuppy

博文

双同源重组技术:“心脏干细胞”疑云催生的巧思 精选

已有 5422 次阅读 2018-10-26 17:45 |个人分类:东张西望|系统分类:观点评述

 (注:纯粹出于个人好奇编写了这篇文章,难免有不准确的理解和论述,如有不妥,恳请指导,先谢过啦。)


20181015日,哈佛大学相关人士告诉媒体:“在对Piero Anversa博士前实验室进行的研究进行审查后,我们确定了31份包括伪造数据的已出版论文,现在我们已经主动通知了所有相关期刊。”涉事论文若全部撤回,开创心脏干细胞治疗研究领域的Piero Anversa将进入全世界撤稿研究人员排名前20位。

消息在国内引发大量关注,这一重大学术不端事件的后续处理,是否会对国内学术圈生态有所触动,一时间众说纷纭。

关于“撤稿事件”已经有非常多的报道和分析文章,本文关注的对象是其中一位来自中国的科研人员——中国科学院生物化学与细胞生物学研究所的周斌研究员,正是基于他的研究结果,干细胞领域的另一位大牛Jeffery Molkentin才在评论文章里放言“成年哺乳动物心脏缺乏内源性再生干细胞”,为十多年的争论做个了结。

周斌

中国科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员

E-mail: zhoubin@@sibcb.ac.cn

长期致力于谱系示踪新技术研究,并利用新技术探索细胞命运可塑性及其分子机制,代表性研究成果多次在NatureScienceNat MedNat Genet等国际学术期刊发表,其中发现新生期心脏具有重新生成冠状动脉的能力入选“2014年度中国科学十大进展”。

 

一、重新聚焦

此次事件表面上的焦点当然是Piero Anversa,然而事实上Anversa早在2013年就被哈佛大学调查,2014年即有1篇论文被撤稿,2015年被免去哈佛大学教职,2017年被美国政府罚款1000万美元。现在的事态只是同一个丑闻的后续发展,并不具备最初爆发时的轰动效应。

image002.png

把焦点换到质疑方的代表人物,来自辛辛那提儿童医院的Jeffery Molkentin,他于2014年在《Nature》发表的论文对c-kit阳性干细胞修复心肌的效果提出质疑,Anversa的好运终于走到头。但是,类似的质疑声从2004年就开始出现,伴随着心脏干细胞研究十几年的发展,其中很重要的原因是研究人员把重复Anversa的实验作为主流策略,虽然无法得到同样显著的效果,但也不是完全阴性的结果(现在更多研究认为移植的干细胞的分泌物会有助于心肌修复)。20183月,Jeffery Molkentin还在《Nature》上与来自意大利的课题组争论,对方认为选择Kit基因位点用于细胞谱系追踪干扰了干细胞的正常分化,都无法说服对方。学术论战的胶着状态没有根本改观,一直到20184月周斌课题组在《Circulation》在线发表新方法对心肌细胞谱系示踪的结果,再到20188月正式见刊时借同期Jeffery Molkentin的评论文章,才算告一段落。

 

接下来把焦点转到周斌,来自中科院上海生化所的优秀研究员,通过总结传统同源重组技术在心肌干细胞谱系示踪里的不足,他建立了一套双同源重组示踪报告基因系统(Dual-recombinase-activated lineage tracingDeaLT),以非常巧妙的设计避开对细胞正常表达和分化的影响,实现了同时对肌肉细胞和非肌肉细胞进行谱系示踪,并且摆脱了对Kit位点的依赖,最终揭示了心肌再生中肌细胞生成肌细胞,而不存在非肌细胞向肌细胞的转化。Jeffery Molkentin在评论文章中用“优雅(elegant)”形容这套方案,直接指出随着周斌课题组研究的发表,“目前正在进行和计划进行的心脏细胞移植临床试验需要进行重新评估,因为我们不再理解其背后真正的机制”。Molkentin没有明说的是,周斌建立的这套DeaLT示踪系统应用潜力巨大,几乎适用所有的干细胞研究,“心脏干细胞”研究方向发生的一切,完全可以套用在其他器官组织的研究中。我们可以想象,DeaLT系统的破坏性和创造性会是同样惊人,它能提示有机会的研究方向,也会宣告一些研究方向的终结,无论哪种结果,都是科学研究的重大进展。

二、双同源重组(DeaLT

双同源重组技术的基础是传统的同源重组,通过查阅周斌课题组的相关论文,可知他们在Cre-loxP等同源重组系统的应用上积累了大量的经验,与上海南方模式生物科技股份有限公司开展合作,培养了超过15种小鼠模型。双同源重组技术固然是精妙的想法,但归根结底是背后紧密的团队合作和大量的实验支撑。

我选取周斌课题组跟“心脏干细胞”及双同源重组技术相关的部分论文和专利,按时间顺序,试图梳理出整个研究的发展。

 

12016,《Cell Research》:Genetic lineage tracing identifies in situ Kit-expressing cardiomyocytes

 

一切始于Anversa的两个发现:2001年,Anversa研究组就声称他们把来源于骨髓的c-kit+干细胞注入到患有心脏病的老鼠心脏内,这些细胞在9天内成功转化成为心肌;两年后,Anversa又提出心脏里本来就有c-kit+干细胞,可以用来修复心肌。

2014年,Jeffery Molkentin在《Nature》发表论文质疑c-kit+细胞对心肌细胞的贡献,采用的即是Cre/loxP同源重组系统,以Kit基因为标记。该技术的准确性主要依赖于Cre表达的特异性,如果有微量的Cre表达在了非靶向细胞中即为所谓的异位表达,那么谱系示踪结果的可靠性将大大降低,而这也成为了近年来很多科学问题出现争议的主要原因之一。Molkentin的结果里就有微量的c-kit+心肌细胞,所以他的论文标题是《c-kit+ cells minimally contribute cardiomyocytes to the heart》,其课题组最新预印本论文是质疑Sca-1+细胞心源性潜力,由于采用的依然是传统技术,结果里同样有微量阳性结果,因此论文标题也只能写成《Evidence for minimal cardiogenic potential of Sca-1 positive cells in the adult mouse heart》。

周斌课题组这篇论文于201512月在线发表,采用的是与Molkentin课题组同样的策略,得到了类似的结论。也因此被意大利的研究者质疑该方法涉及用荧光标记物标记表达c-kit的细胞及其后代,损害了表达c-kit蛋白所需的基因,损害了祖细胞的再生能力。

但是,周斌课题组文章的重点并不仅仅在于重复Molkentin的研究,而是他们对成人心脏中表达Kit的心肌细胞的存在进行了探讨,表明Kit-CreER标记的心肌细胞可能是由于成体心肌细胞的原位Kit表达,这为后续的研究埋下了伏笔。

 

22016,申请专利:双同源重组谱系示踪技术(审中,20183月公开)

 

论文的发表往往是滞后于实际研究,不要以为周斌只是“蹭热度”(尽管文章是发表在本研究所主办的《Cell Research》上),他已经几乎做好了全部准备。20168月,双同源重组谱系示踪技术已经提交中国专利申请,而上面这篇采用传统同源重组技术的论文直到12月份才发表。

这份专利申请今年3月公开,专利文档里非常详细的说明了双同源重组技术的验证过程,在阅读周斌课题组后续论文之前,非常有必要先阅读此专利。专利摘要如下:

“本发明提供了双同源重组谱系示踪技术,具体地本发明提供了一种双同源重组系统在该系统中LoxP位点与Rox位点相嵌存在,通过该系统,在Cre重组酶或Dre重组酶作用下可以实现优先选择其中一种同源重组反应来阻断另外一种同源重组反应的发生,使用本发明的双同源重组系统可以对微生物、植物、动物进行遗传重组操作。”

他们在这个时候已经解决了传统方法的不足,在双同源重组系统里,利用心肌细胞标记例如Tnni3cTNT启动子等,得以排除非靶向细胞中的异位表达,也不再必须考虑Kit基因标记。

专利已经布局,轮到论文登场,为双同源重组技术解开面纱。

 

32017,《Nature Medicine: Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases

 

通过这篇论文,周斌课题组首次提出双同源重组的概念。将Dre-rox重组系统引入到传统的基于Cre-loxP重组系统的遗传谱系示踪技术中,有效地规避了由于Cre表达的不特异性而导致的非特异性(“异位”)同源重组,实现了更为精准的遗传谱系示踪。

传统的同源重组需要培育一种报告基因小鼠和一种重组酶工具鼠,交配后得到目标鼠。其中关键的报告基因小鼠的设计策略类似下图,在小鼠的安全位点Rosa26定点插入荧光蛋白报告基因,涉及一组重组酶的识别位点(例如Cre-loxP):

image003.png

双同源重组系统里则需要一种报告基因小鼠和两种重组酶工具鼠,交配后得到目标鼠。首先需要向报告基因小鼠里转入双荧光蛋白报告基因(例如ZsGreen/tdTomato),包括两组重组酶的识别位点(例如Cre-loxP/Dre-rox)。根据识别位点的放置顺序,周斌等又设计了交错报告基因(Interleaved Reporter)和嵌合报告基因(Nested Reporter)两种不同的策略:

DeaLT-IR策略:适合组成型Dre与诱导型CreCreER)相结合,报告基因小鼠上包含的两个loxP位点和两个rox位点以交错形式存在(loxP-rox-loxP-rox),例如:

image004.png

DeaLT-NR策略:适合诱导型DreDerER)和诱导型CreCerER)相结合,报告基因小鼠上的loxP位点和rox位点以嵌合的形式存在(rox-loxP-loxP-rox),例如:

image005.png

 

有了关键的双报告基因小鼠,还需要培养符合要求的两种重组酶工具鼠,通过诱导型表达或者组成型表达来调控重组。根据负责模型动物繁育的合作方南模生物的介绍,在该阶段至少已经培育过以下工具鼠:

CAG-Dre:广泛表达的组成型Dre

ACTB-Cre:广泛表达的组成型Cre

Tnni3-Dre:心肌细胞组成型Dre

Kit-CreER:非心肌细胞诱导型Cre(主要在内皮细胞表达,在少量心肌细胞中也有表达)

Krt19-Dre:胆管上皮细胞组成型Dre,在一些肝实质细胞中也有Cre表达,也叫CK19-Dre

Alb-CreER:肝实质细胞诱导型Cre

Alb-DreER:肝实质细胞诱导型Dre

Sox9-CreER:胆管上皮细胞诱导型Cre,在一些门静脉周围的肝细胞中也有Cre表达

 

loxP-rox-loxP-rox排列的IR策略为例,IR小鼠和Kit-CreERTnni3-Dre两种重组酶鼠依次交配,最后得到Tnni3-Dre × Kit-CreER × IR小鼠。用他莫昔芬诱导Cre重组酶表达,则会启动ZsGreen绿色荧光蛋白表达;心肌细胞标记Tnni3引发Dre重组酶表达,则会启动tdTomato红色荧光蛋白表达。通过控制两组重组酶表达的时空顺序,可以实现精确的细胞示踪。

 

在本文的实验中,主要用到了Kit-CreER诱导型表达重组酶工具鼠和Tnni3-Dre组成型表达重组酶工具鼠。

可以看出,在这个阶段,对周斌课题组而言,Kit基因标记已经不再是必须考虑的因素,而且他们已经把DeaLT应用到心血管、肝脏等组织里细胞的示踪研究。这一篇论文里仍然使用了Kit-CreER的数据,也许有呈现研究延续性的考虑,不过大量的篇幅是在阐明DeaLT的思路,心肌干细胞的示踪研究在这篇论文里仅仅是作为一个实例来验证IR策略可行,并用另一个IR策略证明肝损伤后肝细胞能够转分化形成胆管上皮细胞,又用一个NR策略证明肝脏生理稳态和损伤修复过程中Sox9+胆管上皮细胞并不会转分化形成肝细胞,在文章的最后他们还意犹未尽,展示了另外三种IR策略的效果。整篇论文容量极大,逻辑缜密毫无破绽。

image006.png

 

42018,《Circulation》:Genetic Lineage Tracing of Nonmyocyte Population by Dual Recombinases

 

20184月在线发表的这篇“话题终结者”,对于周斌课题组而言,已经没有什么挑战性了。巧妙的策略、大量的实验、稳扎稳打的每一步,剩下的就是如何组织好一篇优雅而充满说服力的论文。待解决的问题很明确:如何排它性地分别标记非肌肉细胞和心肌细胞?

周斌等把两种重组酶工具进行了优化,组成型表达的重组酶标记分别使用了心肌标记Tnnt2Tnni3,诱导型重组酶的插入位点改为Rosa26ACTB泛在表达。组建了两套双同源重组酶体系:Tnnt2-Dre/R26-iCre(强力霉素诱导Cre)、反向的Tnnt2-iCre/R26-DreER(他莫昔芬诱导Dre)、Tnni3-Dre/R26-iCre(强力霉素诱导Cre)、Tnnt2-Dre/Actb-Cre

双报告基因小鼠采用了IR1IR3NR1三种。

结合时空调节,搭配成四种验证策略,对非肌细胞的分化进行了逻辑严密的示踪分析。

策略1Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1

非心肌细胞在胚胎心脏和成体骨骼肌中转化为肌细胞,但在成体心脏中对肌细胞没有贡献。

策略2Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3

继续验证非心肌细胞在胚胎心脏和成体骨骼肌中转化为肌细胞,但在成体心脏中对肌细胞没有贡献。

策略3Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1

进一步验证在成体心脏中非肌细胞并不转化为肌细胞。

策略4Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1

为了达到100%的非肌细胞标记效率,利用NR报告基因小鼠,研究非肌细胞向肌细胞的转化,非肌细胞向肌细胞的转化只在胚胎期而不在成体心脏中出现。

 

和上一篇文章一样,也许是手里可用的数据太多,在文章最后,是利用9种已知非肌细胞分子标记,采用传统的同源重组方法,研究了不同心脏细胞谱系对肌细胞的贡献,加上对照组,光这个“附加”内容就用了10种工具鼠!

周斌是在“炫富”吗?当然不是,这是他为后续论文埋下的又一个伏笔,也是通过这种方式向同行传递信息:DeaLT可以用到这些地方啊!

 

52018,《Nature Protocol》:Genetic lineage tracing of resident stem cells by DeaLT

 

20189月,可以看作双同源重组系统正式“上线”,周斌课题组在《Nature Protocol》上发表了DeaLT的技术论文,从此所有科研人员都可以利用DeaLT开展研究,尚不清楚这个技术能否为混沌的干细胞研究打开新局面,但是有一点可以肯定,类似Anversa的发现,以后很难逃过DeaLT的验证了。

DeaLT的优点

提供了同时追踪两种细胞类型的方法,可在体内同时追踪不同的细胞群;

更精准的谱系示踪。

DeaLT的缺点

与传统Cre-loxP单系统相比,DeaLT系统需要用到3种基因工程小鼠(Dre;Cre;IR1)

小鼠的构建、饲养和繁育工作更为复杂、漫长。

 

DeaLT关键点:Dre的特异性和效率

驱动Dre的启动子的特异性以及Dre的工作效率对于确保精确控制靶细胞中Cre-loxP重组至关重要。并不是所有分化细胞类型的启动子(图1中的细胞B)都适合,因此,在建立DeaLT三基因阳性小鼠之前,必须根据现有文献和数据来选择合适的启动子,并先通过与IR1杂交来对Dre品系进行表型分析与验证。

B-Dre的效率必须很高(接近100%),因此需要选择强而特异的启动子来驱动Dre重组酶表达。B-Dre小鼠必须与R26-rox-stop-rox-tdTomato报告基因小鼠交配来测试Dre的效率。只有在验证Dre足够高效以后,才能与Cre; IR1双阳性小鼠杂交,用于DeaLT系统的建立并进行谱系示踪。

Dre的表达必须是B细胞特异的。DeaLT只能标记A+B-细胞群并鉴定B细胞群中的干细胞。如果A+干细胞也表达BB-Dre-rox重组将阻止A+群体中的Cre-loxP重组,因此DeaLT不能使这种特异性干细胞群(A+B+细胞)被标记。

 

62018,《Development》:Dual genetic tracing system identifies diverse and dynamic origins of cardiac valve mesenchyme

 

Anversa引发的心肌干细胞热潮要迅速降温了,但是对于周斌课题组,他们像找到了一套“配钥匙”的方法,解锁的路才刚刚启程。

20189月,他们发表在《Development》的论文是最新的成果:该研究首次基于Nigri-nox同源重组构建转基因工具小鼠,并利用基于Nigri-noxCre-loxP系统构建了更为精准的双同源重组系统,具有能够在体内同时标记并示踪两群独立的干细胞群能力,并利用此新系统揭示了心脏瓣膜间充质细胞的起源及动态变化。Nigri-nox系统与传统的Cre-loxP系统相结合在体内的成功应用为发育、疾病和再生研究提供了更多的技术选择。

在这篇文章里,用到的Cre小鼠果然来自《Circulation4月文章最后提到的9种!

 

三、是危机还是机遇

先说明一下对Anversa撤稿事件里“心脏干细胞”和“心肌干细胞”的关系。让Anversa到达人生巅峰的研究是关于干细胞对心肌的修复作用,以及成体心肌干细胞的存在,但是如果对“心脏干细胞”进行检索,会发现Anversa的发现带动的不仅仅是心肌修复,而是整个心脏干细胞的研究热度。

image007.png

2001年由于Anversa的论文引发的“心脏干细胞”研究热度,从2015年开始不再呈现增长趋势。经过20年的发展,伴随着对Anversa持续的质疑,也同时带动了对心脏细胞发育领域的深入研究,也催生了DeaLT这样可以广泛应用的实验技术。因为Anversa的学术不端,而怀疑该领域整体的学术价值,是另一种形式的功利主义。

在科学研究里,失败是成功之母,有争议的地方通常也意味着机会。周斌研究员的工作是一个极好的例子,通过梳理相关的论文产出,给我印象最深的是背后强大的逻辑性,正是基于此,研究的推进才显得如此有条不紊,保持极高的效率。一个直观的标准是:读他们的论文令人愉悦。

学术不端的惩罚、学术道德的建设等等是当前全社会都关注的论题,相比来自外界的他律,学术圈的净化最终还是依赖科研人员的自律。是危机还是机遇?是危机也是机遇。




http://blog.sciencenet.cn/blog-306662-1142953.html

上一篇:Endnote X9补丁:修正无法正确导入中国知网、万方题录信息的期刊名称

3 李毅伟 徐磊 李久煊

该博文允许注册用户评论 请点击登录 评论 (11 个评论)

数据加载中...

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备14006957 )

GMT+8, 2019-2-19 02:26

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部