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检测NgAgo基因编辑过程的一个初步设想

已有 3604 次阅读 2016-9-7 17:12 |系统分类:论文交流

    

        之前荷兰的John van der Oost 在nature 发文介绍了一种TtAgo的基因编辑效果,但是编辑效率比较低。他对TtAgo的基因编辑效率为什么低?似乎还没有找出原因。国内韩春雨老师发现提高NgAgo基因编辑系统效率的实验诀窍之一是需要保证NgAgo在表达后立即与gDNA结合,并且设计了导入gDNA的时间梯度为首次导入后, 分别在81224 hr再次导入gDNA, 以提高gDNA的装载效率。那么,A: 为了提高NgAgo的编辑效率,怎么确定NgAgo的表达时间非常关键。B: 同时,NgAgo和gDNA是否偶联作用于DNA可能是确定NgAgo有没有DNA编辑效果的关键之一,也是提高NgAgo基因编辑效率的关键之一,因此,本文设计了一个简单的实验系统以解决这两个问题,本文提出一个可视化检测NgAgo基因编辑过程的一个初步设想。


        材料:1. 红色荧光标记的gDNA(或者其它高检测灵敏度的标记)

            2. NgAgo蛋白基因与GFP基因融合


      方法:用高检测灵敏度的显微镜观察gDNA和NgAgo-GFP的共定位情况。

       

结果:

    1.如果观察到绿色荧光蛋白开始表达,则可能表明NgAgo蛋白开始表达了,可以用流式细胞仪分选GFP阳性细胞(同步化),以提高基因编辑效率。

     2.如果观察到gDNA和NgAgo-GFP(红色荧光、绿色荧光)的共定位成像,则表明:

      A.gDNA和NgAgo-GFP有可能结合上了,这是NgAgo基因编辑系统起作用的首要条件。

     B.如果gDNA和NgAgo-GFP是在细胞核共定位的,则NgAgo基因编辑系统的作用部位有可能为核基因组。


    最重要的一点是这个简单的检测系统有可能找出NgAgo系统基因编辑效率低下的原因,比如gDNA和NgAgo蛋白没结合上(两者没有共定位)、gDNA和NgAgo蛋白没有被运输到细胞核(两者没有在细胞核共定位)。


   那么怎么确定此NgAgo基因编辑系统结合到核基因组呢,如果细胞核共定位的荧光的位置是固定的,则表明有可能结合上了,反之,如果共定位的荧光是流动的,则可能没有结合上,也就谈不上基因编辑。



                 示意图(红点为gDNA,绿点为NgAgo-GFP,紫色双链为DNA链)


    本文完成比较草率,是一个粗糙的检测系统,错误在所难免(比如标记后的gDNA是否会影响与NgAgo的结合等等),欢迎大家批评指正。

 

       

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