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样品分离技术“加速度”

已有 2217 次阅读 2014-2-19 09:08 |个人分类:科研路上|系统分类:科普集锦

样品分离技术“加速度”

作者:Mike May /文 高大海 姜天海 /译

(科学新闻2014年1月刊 科学·生命)


在许多方面,分离科学中最突出的一些进步来源于技术的应用方式。例如,在代谢物组学研究中,研究者尝试着从生物体的代谢物中分离出所有的物质成分。这些生化途径副产品的研究为科学家和技术提出了一定的挑战,因为代谢物的物理性质千差万别,例如,大小、电荷和浓度。为了解决这些问题,位于登顿市的北德克萨斯州州立大学生物科学教授Vladimir Shulaev表示,“我们致力于研发出代谢组学的新应用和新的分析方法。”例如,Shulaev和他的同事探索着利用液相色谱(liquid chromatography,LC)的高级模块去筛选代谢物。

 
Shulaev和其他的科学家依赖于一批分离技术的集合,包括液相色谱、气相色谱以及整合两者特点的技术等。新分离技术的发展让研究者通过小块分割,更好地了解到基础的生物系统。分离技术对于很多应用科学领域也同样重要,例如制药工业的药物发现与发展。
 
技术发展趋势
 
尽管分离技术包括一系列工具,但业界的代表还是能够找出这些技术发展的总体趋势。举例来讲,位于印第安纳州印第安纳波利斯利的贝克曼库尔特生命科学公司分析产品部高级市场经理Ed Horton说,“市场追求的是速度和(更好的)分辨率,这些似乎是所有技术的驱动因素。”
 
Horton提到的另一项重要趋势是,“分离技术开始越来越趋向于一站式方案。”也就是说,这些技术开始更专于具体的应用。他举例说,具体技术现在已经可以用于分离复糖、完整蛋白质、多肽和离子。
 
在液相色谱中,基础技术的改变可以加速分析过程。位于德国达姆施塔特的默克集团分析层析部全球产品经理Egidijus Machtejevas说,“单片技术是层析技术的未来。”在传统的层析法中,样品通过微粒堆积的色谱柱移动,而单片技术则使用多孔硅胶棒填充的色谱柱,例如默克的Chromolith高效液相色谱柱。这种单片方法运行速度比基于传统微粒的色谱柱要快四倍。另外,Machtejevas指出,科学家可以简单更换液相色谱系统中的色谱柱,就能够轻松升级为单片技术。
 
除了更换色谱柱,不同形式的层析法能够用于分离样品中各种组成部分。有的方法更适合分离具有特殊性质的组分。例如,亲水作用液相色谱法(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)能够出色地找出极性小物质。“我们有两种亲水作用液相色谱法的产品,ZIC-pHILIC聚合色谱柱和SeQuant ZIC-cHILIC色谱柱,它们能够分离非常具有挑战性的物质。”Machtejevas说。例如,ZIC-cHILIC色谱柱能够用于分离婴儿食品中的三聚氰胺和三聚氰酸。
 
样品中的带电组分也能够通过离子交换色谱法(ion-exchange chromatography,IC)进行分离,该方法使用带电荷位点的色谱柱去分离离子。位于美国加州森尼维尔的赛默飞世尔公司层析部市场经理Linda Lopez表示,当“你在单位时间内需要更多信息进行离子洗脱时”,离子交换色谱法会是个不错的选择。她接着说,“这对于分离碳水化合物和多聚糖类非常有效。你可以选择性地分离高度分支化的碳水化合物。”对于代谢组学感兴趣的研究者经常会研究这些分子,特别是多聚糖类。赛默飞世尔公司的ICS-4000和ICS-5000专门用于微管型的离子交换色谱法系统。“这些系统完全不需要试剂。” Lopez说,“你只需加入去离子水即可。”因为分离技术在毛细管进行,这些系统甚至都不怎么需要水——据产品资料说明,ICS-4000系统每年仅需要5.25升水。
 
分离技术的许多进展都聚焦于固定相——就是色谱柱中用于捕获所需样品元素的成分,但是流动相或溶剂也同样重要。携带样品通过色谱柱的溶剂在整个分离中扮演着同样重要的角色,另外,在溶剂中加入不同的添加剂也能提高分离效果。“蛋白质和氨基酸分离的黄金搭档是三氟乙酸(TFA)添加剂。”位于美国伊利诺伊州的CovaChem公司高级化学家 Tony Nooner说。然而,如果用质谱(mass spectrometry ,MS)来分离分析物,三氟乙酸则会降低样品中的离子化效率,这样实际上会遮蔽一些多肽。为了保持分离的质量,同时使用质谱进行灵敏度分析,CovaChem公司因此推出了一种溶剂-催化剂的混合物,也就是0.1%的乙酸和0.01%的三氟乙酸。Nooner说,“这样就打造了最优峰值分离和高效分离物离子化之间的良好平衡。”
 
转向HPLC的方法
 
起初,液相色谱中的流动相由重力推动,变成了所谓的低压液相色谱。但科学家通过泵推动流动相,研制出了高效液相色谱技术(high-performanceliquid chromatography,HPLC)。(有时候,高效液相色谱技术甚至被描述为“高压(high-pressure)”液相色谱,而不是“高效(high-performance)”液相色谱)。通常来说,高效液相色谱技术可以在高达5000磅平方英寸(psi)的压力下工作。超高效液相色谱技术(Ultra-HPLC ,UHPLC)系统的压力则可达到18,000磅平方英寸或更高。
 
在液相色谱中增加压力可以帮助科学家更加彻底地进行物质分离。位于美国加州圣克拉拉的安捷伦科技公司分析型高效液相色谱技术产品经理Jens Trafkowski介绍,超高效液相色谱技术为分离技术提供了分离中“增加效率和分析效能的能力”。
 
一些科学家在同时运行着高效液相色谱技术和超高效液相色谱技术。例如,一家制药公司已经依赖使用高效液相色谱技术进行制药过程中的保真分析,并不想做出改变,但他们也想利用超高效液相色谱技术探索新的分析。安捷伦公司开发出了1290 Infinity Quaternary液相色谱系统来运行两种方法。为了在超高效液相色谱技术上运行高效液相色谱技术方法,安捷伦公司研发了智能系统模拟技术(Intelligent System Emulation Technology,ISET)。该技术可将一个平台上的方法转移到另一个平台上,包括旧版的Agilent液相色谱平台甚至是竞争对手的系统。
 
其他公司也研发出通用的液相色谱工具。例如,位于美国加州托伦斯的Phenomenex公司为LC色谱柱提供了称为Kinetex的核-壳技术。“这些色谱柱可用在最新的超高效液相色谱技术系统上,也可以用在使用低压的老高效液相色谱技术上。”Phenomenex公司产品经理 Michael McGinley说。2012年底,Phenomenex公司为Kinetex产品线增加了一种在小规模制备液相色谱中使用的5微米色谱柱和一种在超高效液相色谱技术系统中使用的1.3微米色谱柱。
 
“我们提供多种微粒尺寸,因此我们的色谱柱是独立于分析平台的。”McGinley解释说,“旧的仪器也能够运行5微米和2.6微米的色谱柱。”
 
下一代层析术
 
有些人认为层析法大多是通过小的进展持续积累,然而美国加州赫拉克勒斯的伯乐公司层析市场经理Richard Lee坚信他们公司的下一代层析技术(next generation chromatography,NGC)将带来巨大的改变。下一代层析技术基于一种即插即用格式的模块化组分,这种模块化使得NGC可以通用。“客户可以购买他们需要的任何组分——例如用于传递缓冲液和样品的泵、不同的检测系统、或者缓冲液混合物——并将他们加入下一代层析技术,以扩展它的能力。” Lee说。
 
Lee 说,“不是所有使用层析术的人都是专家,因此他们可能并不熟悉如何恰当的查明系统或者编写方法程序。”利用下一代层析技术系统的ChromLab软件,当用户点击一个流程,LED指示灯就会在硬件上闪烁,指示哪处必须要进行连接。
 
高级的分离也得益于其他技术。位于美国马萨诸塞州贝弗利的Sage Science公司研发出能制备DNA的分离技术,具有各式应用,包括下一代测序技术。对于这样的应用,Sage Science公司的首席科学官Chris Boles说,“大小的分布必须相当紧凑。”这就意味着在小比例的目标长度范围内收集DNA。这项技术也应得到尽可能多的目标DNA,并且具有高度的可重复性。
 
在大多数情况下,标准的直流电源驱动电泳来分离的DNA在琼脂糖胶中运动。Boles说,“去年以来,我们引入了一台BluePippin来进行脉冲场电泳。传统的直流电泳可以让你分离高达10000到15000个碱基的DNA样品,然而我们的脉冲场技术将这一范围扩展到了50000个碱基。”他接着说,“脉冲的电场延缓了大DNA分子的电泳过程,就分子量进行分离而言能为你提供极好的分辨率。”这一技术也可以用于分离蛋白质。
 
生物制药机遇期
 
如今的许多药物都属于生物分子,包括生长因子和干扰素。“主要的分离挑战在于这些生物分子正变得更加复杂。”近期被美国生命技术公司收购的BAC BV公司首席执行官Laurens Sierkstra说。“大多数的生物制剂过去都十分简单,有着单纯的重组蛋白和明确的抗体,但是如今则完全是分子的新浪潮,包括经过改进,具有延展半衰期和抗体片段的生物制剂。”他接着说,“从分离的角度来说,这使得所有的事情都变得愈发复杂。分离过程的研发也是繁复的,甚至变本加厉。”
 
BAC公司的捕获选择(CaptureSelect)技术是一项基于抗体的分离技术,能够大规模工厂化用于纯化生物试剂。生命技术公司提供一系列的产品对抗体、病毒和其他生物制剂进行纯化。Sierkstra指出,美国的生物技术公司Biogen-Idec公司已经利用捕获选择发展出一套纯化策略,用于它们的重组因子VIII-Fc融合分子,并且已经向美国食品药品管理局提交了生物制剂许可的申请。这一生物制剂能够治疗A型血友病(一项降低血液凝结能力的遗传缺陷),而且它是一种VIII型长效重组因子。“Biogen想要一种非动物源的纯化过程,而我们向他们提供现成的纯化产品,让一切变得简单。”Sierkstra说。
 
生物药物和生物仿制药(十分类似于创新性生物治疗的生物医药品)这样的工作可能会推动市场对于分离技术的需求。原始的生物制剂和生物仿制药都必须在研发过程中得到鉴定。对于这种鉴定,Horton表示许多公司使用贝克曼库尔特公司的PA 800 plus药物分析系统。这个平台利用基于十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)的毛细管电泳技术进行分离。“这可以用于分析具有电荷异质性、分子量异质性及其他特点的样品。”Horton说。
 
这一平台也能够用于其他的应用领域,例如代谢组学。尿液通常包括高度电荷化的组分,通常可以成为这些研究的样品。正因为这个电荷,Horton说,“除非使用毛细管电泳技术,否则你会失去一大类的代谢物。”
 
技术整合
 
分离技术经常与检测技术相整合。实际上,位于美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的PerkinElmer公司全球质谱商业化部门负责人Hayley Crowe介绍,“在液相质谱联用(LC/MS)或气相质谱联用(GC/MS)的分析中,有些仪器在许多实验室经常被当做检测器。”她接着说,“由于这些概念来源于那些没有经过质谱培训的人。因此我们必须在保证质谱结果质量的情况下,找到方便使用的仪器。”
 
为了解决这一需求,PerkinElmer公司开发了AxIONiQT气质联用质谱仪。Crowe说,这一仪器包括了专利化的质谱技术方法,提供了宽泛的动态量程,类似于三重四极质谱仪,但也具有四极飞行时间质谱仪(quadrupole time-of-flight MS)的准确性和速度。为了面向缺乏经验的用户定制易于运行的仪器,软件负责处理大部分操作,包括在分析已知组分时进行自动的最优化设置。这一点尤其有用,Crowe说,“人们需要用它检测达到检出水平的高污染样品。”
 
为了得到样品中组成物的更多信息,科学家能够使用不同的分离技术。例如,位于美国马萨诸塞州米尔福德的Waters公司的ACQUITY UPC2系统为用户提供聚合层析法。项目经理Mark Baynham解释说,这套系统“使用压缩的二氧化碳气体和液体作为助溶剂。”有了这些溶剂的组合,这一技术可以找出液相色谱或气相色谱分离中可能重叠的组分。如果样品的组分不能清晰地得到分离分析,那么检测器就可能错过。Baynham说,“例如你在寻找制药的污染物时,你想要确认没有任何隐藏了,这时(ACQUITY UPC2)系统能够找到其他技术可能错过的东西。”他接着说,“分离和检测任何一项都不是最终的解决方案;两者的最优组合才能获得最佳的分析结果,而我们的工作正是确保(我们的技术)与整套质谱仪相匹配。”
 
从样品中分离大量不同组分需要一系列的工具,但是说到底,科学家选择的分离技术也必须最优化,方便随后的检测方法,例如质谱法。样品的分离往往不是孤立的,而是一项包含诸多新发现的重要科学过程的早期步骤,包括从揭秘生物体的代谢组到找到对抗癌症的关键分子。■




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1 郑永军

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