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新技术助蛋白质转印法提速

已有 2354 次阅读 2013-12-13 15:03 |系统分类:科普集锦

新技术助蛋白质转印法提速

作者: Anne Harding /文 高大海 姜天海/译

http://www.science-weekly.cn/skhtmlnews/2013/9/2147.html

在发明蛋白质印迹法(Western Blot)出现了30多年之后,这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。
 
有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法,但其中只有一人才算得上是“Western Blotting(蛋白质印迹法)”的命名者,他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting(Edwin Southern在1975年发明的一项技术,使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列)、Northern Blotting(随后发明出的相似策略,用于鉴定RNA)以及位于西海岸(West Coast)的Nowinski实验室三者之意。
 
Burnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来,当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此,这个名称还是沿袭了下来,而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。
 
工作原理
 
蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳(Gelelectrophoresis)按照大小分离蛋白质,然后通过将膜置于胶上,将蛋白质转移到膜上(通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜),并在膜上加上若干片吸水纸,然后将这套堆层放在缓冲溶液中,这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。
 
另外两项技术是干法和半干转印法,这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整,但是对于高分子量蛋白质而言,效率更低。对于半干转印方法来说,膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间,将这些都夹在阴极和阳极之间,电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中,干法转印最快,但转印效率也最低。
 
转印结束后,膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱,再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。
 
最后一步是检测,通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中,与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应,可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中,抗体探针被荧光集团所标记。
 
荧光检测方法的主要优势在于,它可以同时检测多个蛋白质,并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比,也更有利于量化研究。
 
不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化,期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点,让研究人员能够随时监测实验进展,甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化,从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。
 
加速免疫检测过程
 
转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间,EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。
 
这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程,使用真空装置通过膜推入试剂,而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟,Hatler表示。她解释说:“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走,只是加了一个真空装置。”
 
Hatler指出,2.0版本是于2012年9月推出的,相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶(8.5×13.5厘米)和迷你凝胶(7.5×8.4厘米),之前则只能用迷你凝胶。
 
“这一设备很便宜,操作也很简便,但切实提高了实验效率,节省了实验时间。” Hatler说。
 
伯乐公司(Bio-Rad)的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器,能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方,特殊的过滤材料和增强的电流强度(由一个集成电源调节),这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印,并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间,而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。
 
增加验证点以缓解忧虑
 
蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧,尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术,”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说,“我们对用户调查时发现,一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”
 
Short还说:“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”
 
这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶,利用其ChemiDoc MP胶成像系统,使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上,进而确证高质量的蛋白质转移,便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计,能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。
 
这些验证点“真的很有用”,在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示:“我们可以成像这些免染的凝胶,不用加入额外的染料,而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像,如果其中任何一个步骤出现问题,我们都可以在这一点上停止实验进程。”
 
成像和软件提高定量性
 
当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时,世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统,这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力,争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统,其大小可在实验台上操作。
 
Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi,分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统,并配有GeneSys成像软件。
 
2012年10月,赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Scientific)推出了myECL成像仪,使用紫外和可见光透射法,专业的滤镜和电荷耦合器件(CCD)摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。
 
CCD照相机的灵敏度比X射线胶片高两倍,据该公司介绍,该仪器的动态范围高达10倍。用户只需简单地按下触摸屏上其中一个最优预设按钮,无需调焦或调节照相机的设置。用户也可以设置定制曝光,并可同时设置多达5个不同的曝光,或者使用预设的曝光参数。这台成像仪占用的仪器空间很小,可以在实验台上使用。
 
Aplegen公司的Omega Lum G凝胶记录系统也具有自动聚焦的特点,可以在实验台上操作,并配备了一台整合的平板电脑。UVP公司在2012年1月推出了Chemi-Doc-It TS2成像仪,其特色在于整合的电脑和触摸屏,允许用户调节曝光、光圈、放大缩小和焦距等参数,当用户按下实时预览(Live Preview)按钮时,还能提供图像实例。
 
LI-COR公司最新的红外成像系统版本是Odyssey CLx,该版本具有超过6对数的动态范围,而前一个版本只具有超过4对数的动态范围。当对蛋白质印迹结果进行解析时,这一增大的范围能消除饱和度,提供了更宽的线性范围可以转换为定量数据。
 
“研究者在他们的印迹中不仅不会达到饱和,而且他们还可以将多重印迹结果放进成像仪中,根本无须担心为这些印迹进行不同的设置调整。”位于林肯市的Nebraska公司高级产品市场经理Jeff Harford解释说。
 
Rehana Leak是位于匹兹堡的美国迪尤肯大学(Duquesne University)的助理教授,她使用LI-COR的Odyssey CLx系统进行细胞如何适应低水平胁迫的研究。“Odyssey成像仪的优势在于它是16位的成像仪,并且具有700和800纳米两个红外波长,一次能够成像两个斑点。” Leak说,“这意味着我们可以一起检测磷酸化和全部构象的蛋白。”两个蛋白亚型通过其他方法很难进行同步区分,因为它们的基团非常相似。
 
Leak指出,Odyssey成像仪能够可视化216个红外线信号暗影,与之相比,X射线胶片只能灰度的呈现150个暗影。“这将从150个跃迁到65000个红外暗影,因此这种方法可以获取更高的分辨率。”她接着说,“这是不同寻常的定量化。”
 
2012年12月,LI-COR公布了一套新的数字成像系统,即C-DiGit系统,能够用于化学发光印迹。该系统将于2013年推出。“就像最近这些年数码照相机取代胶片相机一样,我们认为C-DiGit系统必将替代胶片化学发光。” LI-COR资深科学家Jon Anderson说,“这项技术能提供胶片用户所习惯的所有灵敏度和图像质量,同时显著提升了数字图像的质量。”
 
软件始终保持直观
 
传统的软件分析蛋白质印迹时需要用户从图像向电子表格导出数据,而后续的均一化计算和分析都由手动完成。BioRad于2012年9月发布的Image Lab 4.1软件,针对看家蛋白或总上样蛋白提供嵌入式、自动化的均一化。
 
“这是目前我在市面上见到的最好的产品之一。”Gomes说,他正在研究蛋白酶体和肌钙蛋白在心脏和骨骼肌组织中的作用。“最好的一点是,它是完全免费的。”Image Lab 4.1软件比他之前在实验室用过的图像分析软件都要简便,Gomes接着说,几乎每个人都能掌握。“这的确增强了我们定量蛋白质的方法。”
 
LI-COR公司也已经推出了新的成像软件——Image Studio,能与其Odyssey系统一起使用。用户只需选择一个检测通道,然后按一个按钮就能获得一张图像。这个软件的新版本提供毫米间隔的分析,而不是厘米间隔的,同时又能够执行完全的自动和手动分析。
 
重新打造蛋白质印迹
 
除了对传统的蛋白质印迹技术进行微调,ProteinSimple公司的Simple Western系统对其进行了重新开发,用毛细管电泳使整个过程完全自动化。在2011年,该公司推出了Simon,计划使用该仪器全面取代蛋白质印迹法。Simon能够基于大小进行分离、免疫检测、洗涤、化学发光检测和定量分析。科学家们仅需要加上样品,然后离开,稍后回来就能得到完全分析好的数据。Simon甚至能够发出蜂鸣声告知用户结果出来了。
 
该公司紧接着在2012年初推出了Sally,该仪器允许用户在一次实验中进行96个Simple Western。而最新的设备则是2012年9月推出的Peggy,能够一次分析96个样品,并能按照尺寸或电荷分离蛋白。Simple Western克服了传统蛋白质印迹法中手动部分的缺陷,比方说缺少重复性或定量化结果。此外,在传统蛋白质印迹法中,多重检测已经成为一种挑战。研究者现在可以利用荧光去观测一个样品中的2个或3个蛋白质,转移的设备可以一次同时跑8块迷你胶或4块中等大小的胶,但这已经是传统蛋白质印迹法所能达到的极限。Simple Western能够在每个毛细管中多重分析蛋白质,从而在本质上消除传统蛋白质印迹法的限制。
 
对于斯坦福大学医学院的肿瘤学教师Alice Fan来说,Simple Western技术最令人兴奋的事情在于它分析显微级别样品的能力。
 
Fan收集病人组织样本的时间已经超过10年,她一直在等待那个能够让她分析肿瘤细胞蛋白质组的工具,而且还无需用去整个样品。“我找寻了多年,希望有一个设备能够用极少量的组织进行蛋白质印迹。”她解释说。
 
除了帮助她保存之前储存的组织之外,Sally还让Fan可以使用细针穿刺法多次从病人身体中提取一些样本,而不是做全面的活体检视。Fan希望,这将能够帮助她实时观测病人的肿瘤对药物产生的反应。“在描述不同类型的肿瘤方面,这真的对我的研究大有裨益。这是巨大的进步。”
 
默克公司(Merck & Co)疫苗生物化学团队负责人Richard Rustandi在2011年底购入了一台Simon仪器。当时,他并没有抱有很高的期待。但是,他说,他得到了意外的惊喜。“这台仪器太棒了,我们在几个月后又买了一台。”
 
据Rustandi介绍,尽管Simon并不是完美无瑕的,但它能够真正实现定量化。他接着说,手动的蛋白质印迹法通常具有35%到45%的变异率,但他和他的实验室能够将Simon的变异率控制在10%以下。
 
随着蛋白质印迹技术地不断演化,研究者最终不用像保姆一样,花费大量的时间照看着他们的实验。“他们的时间非常重要。” Simple Western的产品经理Peter Fung认为,“你的时间利用率越高,就越能做出好的研究。”■





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