1. HiCUP安装

HiCUP需依赖Perl，Bowtie/Bowtie2，R以及Samtools

在官网http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/hicup/下载最新版的HiCUP，例如目前的最新版是v0.6.1

wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/download.html#hicup

# 下载到压缩包hicup_v0.6.1.tar.gz

tar -zxvf  hicup_v0.6.1.tar.gz

# HiCUP是Perl写的解压即可使用，无需编译

HiCUP中的比对工具是Bowtie/Bowtie2，建议采用最新版的Bowtie2。和HiCUP一样，Bowtie2有Linux二进制版，解压即可使用，无需编译

2. HiCUP的比对策略

HiCUP由6个Perl脚本组成，分别如下：

(1) HiCUP Digester：确定reference上的酶切位点

(2) HiCUP：为主程序，依次执行以下步骤

(3) HiCUP Truncater：在reads上寻找酶切位点，并将reads切开

(4) HiCUP Mapper：将reads比对到参考基因组上，如果输入的是PEreads，则R1和R2分开单独比对到reference上。比对内部调用bowtie或bowtie2比对。这一步会利用到事先建好的bowtie2 index

(5) HiCUP Filter：结合HiCUP Digester生成的酶切位点文件，过滤掉常见的Hi-C artefacts，例如Dangling Ends等

(6) HiCUP Deduplicator：移除(仅保留一处最佳比对) PCR重复

3. HiCUP的使用

3.1 先采用bowtie2-build对reference建立索引

/path/to/bowtie2-build reference.fasta reference

3.2 采用hicup目录下的hicup_digester在reference上寻找酶切位点，生成酶切信息文件

/path/to/hicup_v0.6.1/hicup_digester \

     --re1 ^GATC,MboI \

     --genome reference \

     --outdir /path/to/output/dir \

     reference.fasta

3.3 再采用hicup主程序进行分析

有两种方式运行hicup，其一是将所有参数写到config文件中，可以先运行

hicup --example

生成样例config文件，修改其中的参数，并运行

或者直接用命令行运行，如下：

/path/to/hicup_v0.6.1/hicup \

     --bowtie2 /path/to/bowtie2 \

     --digest Digest_reference_MboI_None_18-36-52_07-08-2018.txt \

     --format Sanger \

     --index /path/to/reference/index \

     --keep \

     --outdir /path/to/output/dir  \

     --threads 40 \

     /path/to/reads*.fastq.gz

4. 结果解读

最重要的两个文件是：

Ø  xx_R1_2.hicup.sam

Ø  xx_ R1_2.HiCUP_summary_report.html

前者是最终的sam文件，后者是全程汇总报告

每步结果具体如下：

HiCUP运行后hicup_truncater先生成xx.R1.trunc.fastq和xx.R2.trunc.fastq文件，它是按照酶切位点对Reads进行切除，因此得到的reads长短不一。完成后会统计Truncated reads数，Not Truncated reads数，以两者的占比，总的reads数，平均reads长度，并记录在hicup_truncater_summary_xx.txt文件中。两个fastq对应的svg图像中仅绘制了前两项的条形图。

hicup_mapper调用bowtie2-align-s进行比对处理，生成xx_ R1_2.pair.sam文件，同时也统计了太短而无法比对的reads数，唯一比对的reads数，多处比对的reads数，比对不上的reads数，成对的reads数，以及以上各项的占比，记录在hicup_mapper_summary_xx.txt文件中，顺带还画了R1和R2的比对结果条形图(xx_R*_trunc.fastq.mapper_barchart.svg)

hicup_filter对上步生成的sam文件进行过滤，分别将每种invalid ditag类型(包括same internal，same dangling ends，same circularised，re_ligation及其它)过滤掉的比对结果写入到hicup_filter_ditag_rejects_xx/目录下

过滤后可用于下步分析的sam文件为xx_R1_2.filt.sam

当然，对结果ditag结果也进行了统计，包括valid pairs，invalid pairs，same circularised，same fragment dangling ends,same fragment internal, re-ligation, contiguous sequence, wrong size以及total pairs等类型，记录在hicup_filter_summary_xx.txt文件中。同时也画了Di-tag长度分布svg图和各种类型的svg piechart图。

hicup_deduplicator去重，并且计算了序列内的unique reads(<10kb和>10kb分别统计)以及序列间的unique reads，并画了相应的svg图

最终的结果为xx_R1_2.hicup.sam

注意，这个最终的sam文件中仅存放De-duplication后Unique Di-Tags的Read Pairs，即如下图中的read pairs（强调：是read pairs！）

最后不仅给出了所有步骤reads数据变化的汇总(HiCUP_summary_report_xx.txt)，同时还给给出了非常美观的html报告(xx_ R1_2.HiCUP_summary_report.html)！

另外，需要强调一点，hicup的结果如果想接到Lachesis做组装。在hicup生成的sam转bam的时候一定要用sort -n，按名字排序！如果用默认的参考序列位置排序，则Lacheis中会生成Cluster信息，但是没有Order信息！

运行效率：

PE reads总数据量45G，参考基因组440M。运行指定40个核，估算出的CPU最大消耗35个整，最大消耗内存6.34G，运行时间约7.5h，最大消耗是hicup_mapper比对。