上周末和周一用iCubate2.0 iC-Architect软件设计了一套多重PCR试剂，共八个靶点，加上内对照九个位点。这是一个新产品，临床应用的。多重PCR之所以难做，问题的关键是多个靶点扩增条件不兼容。每个靶点都需要两边的引物配合。打个比方，PCR就像“三条腿赛跑”：

每个靶点的成功扩增都需要被捆绑在一起的两个人（一对引物）配合默契。而做多重PCR就需要多对选手同时起跑又同时到达。如果被捆绑在一起的两个人一个高一个矮，一个跑得快一个跑得慢，不协调，这一对人就不能取胜。那还只相当于一个靶点扩增的失败。多重PCR要求所有参赛的每对选手都有最好的，而且均衡的发挥。

我们做过实验（不久会发表），如果引物设计不采取任何辅助工具，闭著眼睛设计，PCR的成功率大概在70％左右；如果用TM评估软件辅助设计，成功率大概85%左右。也就是说，就单靶点反应来说，失败的几率是15%。当然通过优化，调节温度，离子浓度等95%左右的靶点最后都能获得成功扩增。可是“优化”工作做得越多，该反应就越“特别”，该靶点能和其它靶点同时扩增得机会就越少。

这里有个简单的计算题：假设每个靶点（在不经过优化的前提下）的成功率是85%, 同时能成功扩增5个靶点的几率是多少？

x = 0.85*0.85*0.85*0.85*0.85=44%

这就是为什么多重PCR难做的原因。试图同时扩增的靶点越多，成功的几率就越小。

我们的引物设计软件（免费）首次应用了多聚酶亲和指数(PPI)的概念，可以把引物设计成功率提高到95%左右。同时，arm-PCR更进一步解决了靶点不兼容的问题。

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