多聚酶亲和指数PPI (polymerase preference index)是我们最近的一个发明（专利上个月申请进去的）。PPI的主要用途是提高引物设计的成功率。

我在以前的博客里 面讨论过一般设计引物常犯的一个错误：一般的引物设计软件的“计算”核心公式是计算引物的TM值，用TM值来估算引物和靶基因片段结合的最佳温度。可是这 些计算有三个最根本的缺陷：（1）TM值的计算公式有多个，同一个引物使用不同的公式会得到很不相同的TM值。说明TM值的估算很不精确。（2）TM值的 计算一般都需要加入很多相关的修正系数（反应物浓度，例子强度，酶浓度等），而我们在使用公式时通常没有考虑一些关键的系数；（3）也是最重要的，TM值最多仅能告诉我们引物是否能在（温度）相同的条件下结合到模板上去，可是TM值并不能告诉我们引物是否对酶的亲合性是一样的？酶对这些引物的使用率是否有差异？

一个成功的PCR反应，需要两个引物同时上到模板上去，还要以相同的效率从不同的方向合成DNA片段。现有软件的一个最大缺点就是没有去衡量引物和多聚酶的亲合性，不知道贴到模板上去的引物是否被多聚酶所喜欢。PPI所要试图解决的问题就是引物是否被酶所喜爱的问题。

如何得到这个答案？

前不久，我在写这篇博客的时候，提到过一本介绍多聚酶功能的书，封面就有多聚酶的结构示意图：



在复制DNA的时候，多聚酶所覆盖的核酸大概有10个碱基，六个碱基是双链（有引物结合的），另外四个碱基是即将要合成的模板序列。所以这10个碱基对核酸合成来说就很重要了。

我们首先假设多聚酶很挑剔，不是所有的引物（和模板）它都喜欢，至少是它对不同的引物喜欢程度不一样。那么如何知道它到底喜欢那些引物序列呢？

高通量测序给我们提供了一个回答这个问题的机会。我们到别人实验的“垃圾序列”里面去“淘宝”，找到别人用6个核酸长的随机引物做全基因组扩增然后测序的数据，共四百多万条测序结果。有了这些测序结果我们就可以计算PPI值了。

计算公式如下：PPI= A/B*C/D*100.

其中A是测序得到的所有4096种不同的6-mer引物的实际使用频率，B是每个6-mer在扩增产物中的出现频率（代表该6聚体在基因组中的分布频 率），A和B的比值就代表了引物被多聚酶使用的频率；同样，C是测序得到的紧跟引物3'端，被多聚酶覆盖着的四个碱基的频率（我们起名为“跑道”，好比多聚酶起飞的跑道）, D是测序得到的四聚体在扩增产物中的频率（基因组本底频率），C/D代表“跑道”被多聚酶喜欢的程度。

对一个需要设计引物的靶基因序列来说，如果我们用一个移动的，10个碱基的窗口看这个序列，每是个碱基计算一下它的PPI值，然后把这个值交给第窗口中的第六个碱基，然后把窗口向3'端移动一个碱基，继续技术PPI. 这样就能产生出下面的这个图：



 图中绿线和红线分别代表正反两条DNA链上的PPI值。一些峰值代表多聚酶比较喜欢的序列，或者说是比较适合作为引物的序列。横线代表引物的位置。最好是把引物的3’端放在PPI的峰值处，这样该引物的成功几率就会高些。而且，最好是一对引物具有相差不多的PPI值。

PPI可以帮助决定引物做好定位在那里，然后再通过调整引物的长度的办法来达到相同或者相似的TM值。

iCubate2.0软件在做引物设计时，综合考虑了PPI, TM, 和arm-PCR（另外有博文描述）等重要因素。所以是多重PCR设计不可缺少的工具。

即便是把含有PPI技术的软件放到网上让大家免费使用，我们还是为PPI技术去申请了专利保护。申请专利不都是为了赚钱，更重要的功能是使自己对一个技术有使用权（freedom to operate)，支配权。


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