生物技术创新创业分享 http://blog.sciencenet.cn/u/SNPs 美国HudsonAlpha研究院的研究员。做分子鉴别诊断平台技术的开发和免疫组库基础科研。

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多重PCR引物设计的免费软件:iCubate2.0

已有 19508 次阅读 2011-1-28 00:15 |个人分类:iCubate2.0开放平台|系统分类:科研笔记| 创新, 创业, 软件, 多重PCR

iCubate2.0开放平台的关键一环就是网上的免费多重PCR 试剂设计软件。进入开放平台首页(开发中,还没有开通),首先会看到这个页面:


页面上面给iCubate2.0开放平台上面的试剂(iC)做了一个定义:iC, 就是用多聚酶亲和指数(PPI, polymerase preference index)程序, arm-PCR (amplicon rescued multiplex PCR)原理设计出的,在iCubate技术平台上使用的多重PCR试剂

页面下面有三个供选择的区域:iC 建筑师,iC 网店,和iC 社区。在iC建筑师区域设计,改造试剂;在网店进行iC的买卖;在iC社区学习,讨论,交流和获取商机。这篇博客主要介绍iC建筑师。

如果还不是注册试剂开发者,首先要注册获取帐号:



建立帐号的主要目的是建立开发者自己的,有密码保护的专用区域,这样才能对开发的内容保密。每个开发者所开发的所有试剂都有一个特定的帐号记录,今后这个试剂的特定帐号会放到卡盒的二维条码上,这样iCubate仪器才能知道用什么程序,如何做结果分析,如何展示结果。

如果已经是注册开发者了,就通过这个页面可以直接签入iC Architect区域:


进入iC建筑师区域以后,首先要做的是给出对iC的一般介绍:


首先要给你的iC取个名字,这个名字是要放到iC网店上去的,所以要简练,明了。 其次要对您所开发的试剂做一个简单的介绍:试剂的用途是什么?标本是什么?一共要同时扩增多少个靶点?是否需要检测点突变?注意,这里介绍试剂的应用范围等的内容要好好考虑,因为这是将来要放到网店中的卖你的产品的最佳“广告”。

接下来会看到这个网页:


根据上页里面填的靶点数,这里需要收集靶点特异性的信息:

首先是靶点的名称(比如流感病毒H1基因)。靶点名称很重要,它决定展示结果时的基本单位(比如,流感H1阳性)。其次,软件需要知道针对这个靶点,开发者要设计几个amplicon (扩增产物)。虽然对绝大多数多重PCR诊断试剂来说,最终产物里面一般一个靶点有一个扩增产物就够了,但是在开发阶段,为了节省时间(不是反复试那个amplicon 更敏感,特异性更强)可以做2-3个作为“保险”。因为引物现在已经很便宜了,所以可以这样做。如果为了省钱(可能需要多花些时间),也可以一个靶基因,一个amplicon。还有,碰到象SARS, 禽流感等对公共卫生危害很大的病原体,本身突变发生频率又很强的,可以考虑在最终产品里面多方几个amplicon,这样即使其中一个靶点发生了突变,其它靶点还可以协助诊断。

接下来是问针对特定的靶点,是否需要检测点突变?几个点突变?检测点突变就需要我们设计两个Primer Extension的引物,一个是野生型特异性的,另一个是突变型特异性的,然后用universal array上面的两个点的信号强度比来决定标本是否有突变。


如果你的靶点不含有点突变,只要把一段基因序列paste到给出的窗口就可以了。有些网友来信说不知道如何挑选特异性的靶基因片段。我们正在开发另外一个软件,(也会放到网上供大家免费使用)只要给出一个病原体的基因组序号(GenBank里面的序号)软件就自动挑出该基因组最具特异性的基因片段来。

根据我的经验,如果想找特异性的扩增靶点,最快的方法就是google. 比如找流感病毒的PCR靶点,就google "PCR, influenza, diagnosis" 就能发现很多论文描述real time PCR的引物设计。把别人设计的靶点扩大一些,他们扩增150碱基,我就去基因组切出五百碱基来作为设计引物的区域。

如果你设计的扩增靶点含有点突变,这个页面就会出来:


这里需要设计者指出点突变在你给出的序列中的位置,野生型的碱基和突变型的碱基分别是什么?


当把所有需要的信息输入后,按键进行多重PCR引物的全自动设计。电脑就会根据PPI程序和arm-PCR的原理直接计算出引物和探针的位置。

最后的设计结果这个网页会列出明细:


软件会给出每个靶点的每个引物的序列,包括primer extension用的探针的序列。点击靶点还可以看到一个展示PPI的图。

软件也容许设计者对引物进行微调,向前或向后做些移动。另外,每个靶点可能都有机套设计方案,如果首选方案不够理想,日后还可以选择其它引物组合。

如果(在美国)从和我们合作的引物合成厂家订购引物,第一批引物是免费的。这样研发的起始费用就更加低了。

有关PPI 和 arm-PCR的详细介绍我会另外写博客披露的。


从这个软件的流程大家可以看出,设计一个多重PCR的试剂实际很方便,有些经验的人大概不用一个小时就能完成了。虽然我们会在开发者注册时让用户签一个使用协议,说该软件(和其包涵的PPI,arm-PCR等专利技术)仅供那些开发iCubate技术平台专有试剂的人使用。我也知道一定有人会违约用这个软件开发多重PCR试剂然后用其它检测平台。如果那样会有几个致命的局限:(1)首先该用户就不能享受到全自动,全封闭的iCubate技术平台的好处,实验室污染迟早会发生。(2)而且,研发出的“产品”不能享用iC Store的国际化销售平台。(3)没有全自动和全封闭,产品进入市场难,报批难,使用范围毕竟受限。(4)如果不用iCubate平台,我们优化好的反应条件并没有公开,只有iCubate Processor根据卡盒上面的二维条码来给出最佳反应条件(PCR的扩增条件,arm-PCR的一些技术参数), 所以多重扩增的成功率没有办法保障。所以,不用iCubate平台,占个小便宜,最后吃的是大亏。


类似的软件使用协议都是防君子不防小人的,目的主要是保护技术开发者,试剂开发者。开放平台的前提就是大家共同获利。我们尽最大的努力把平台做得更好,更方便,更便宜。也希望用户能珍惜这个机会,维护,共建这个平台。


春节过后,我们会在国内几个大城市举办一系列的培训班,感兴趣参与多重PCR试剂开发的请关注这个博客,最新消息会在这里发布的。




https://blog.sciencenet.cn/blog-290052-408525.html

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