生物技术创新创业分享 http://blog.sciencenet.cn/u/SNPs 美国HudsonAlpha研究院的研究员。做分子鉴别诊断平台技术的开发和免疫组库基础科研。

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免疫组库工作新进展:“诊断正常” 精选

已有 9642 次阅读 2011-1-18 01:57 |个人分类:免疫组库新领域|系统分类:科研笔记| blank, 苹果, 研究院, 斯坦福, 西雅图

回头翻看以前的博客,算算我做免疫组库方面的工作已经有四个年头了。

这篇从苹果网搬过来的博客记录了最早开始为免疫组库项目设计引物时候的情景。时间是07年十二月。而决定去用高通量测序方法做免疫组库研究是在07年的十月份,那是我刚刚离开Qiagen,加入HudsonAlpha研究院。

这篇08年七月的博客记录了我和太太去斯坦福大学访问,那时我们刚刚完成了第一次用454测序免疫组库的工作,得到了很好的结果。在那以前,有关免疫组库方法学的专利已经申请进去了。

首次向外界披露我们的技术是在09年西雅图召开的免疫年会上。论文也是大概那个时候开始投稿的,不过一直到2010年年初我们的论文才在PNAS上发表。

免疫组库测序是个全新的领域,与其它“学院派”科学家不同,我们在做这个项目的时候不是把注意力集中在抢先发表论文上,而是努力把技术做得比别人好:更简 单,更好用,全自动,产品更全,软件更快更好。所以在他人不断发表论文的时候,我们却默默地做了大量技术研发的工作,也抢先申请了一系列的专利

说道专利,我们最近还申请了另一个专利。这个专利的内容在这篇博客里面已经透露了一些。这个新专利是一个诊断产品。不过我们要诊断的不是一个特定的病,而是一个正常指标

事情是这样的,早在09年西雅图免疫年会上,我们就报告了免疫组库在肿瘤病人中有明显的多样性缺失的现象:


如上面的幻灯片所示,正常人的免疫组库(T细胞beta受体)多样性很好,在三维图像上看起来丛林密布;而结肠癌病人或系统性红斑狼疮病人的免疫组库则多 样性缺失,三维图像看上去就是几棵树。这些病人T细胞总数是正常的,可是他们的T细胞功能太专一,缺乏健康人应有的多样性。我们随后做了许多病人,都是如此。

开始,我们也和其它科学家一样,试图通过多做一些病人标本找到更特异性的免疫组库变化:某个特定的VDJ重组总是和某个肿瘤相关。可是,免疫系统潜在的多样性(人可以有10的20次方那么多不同的T细胞)实在太大,找到病人之间共有的特异性VDJ (或者CDR3)可能性很小。那么,免疫组库研究的诊断意义到底在哪里?

受中医思维影响,我对“上医医未病之病”一直感兴趣。可是医未病之病的前提条件就是能够诊断正常:只有能诊断正常,医生才能在病人稍微偏离正常状态时就能知道,及时加以纠正。引申开来,免疫组库技术在能诊断各种特异性疾病的同时,它的一个最好的应用可能就是去诊断正常

如何评估一个人的免疫组库是否正常?

那就看他(她)的免疫组库多样性是否完好。可是作为一个临床诊断,最好要有一个定量的描述。这,就是我们新专利的一个特点和诉求。我们称之为D50(Diversity 50)。下面是专利里面对D50的描述:
 
Aspects of the invention include arm-PCR amplification of CDR3 from T cells, B cells, and/or subsets of T or B cells. Large numbers of amplified products may then be efficiently sequenced using next-generation sequencers.  If the significant percentage that is chosen is 50%, the number may be referred to as the “D50.”  D50 may then be the p
ercent of dominant and unique T or B cell clones that account for fifty percent (50%) of the total T or B cells counted in that sample.  For high-throughput sequencing, for example, the D50 may be the number of the most dominant CDR3s, among all unique CDR3s, that make up 50% of the total effective reads, where total effective reads is defined as the number of sequences with identifiable V and J gene segments which have been successfully screened through a series of error filters. 

所谓D50,就是通过arm-PCR技术扩增免疫组库然后测序。把半定量扩增出的免疫组库和测序结果做sorting, 表达量最高到表达量最低排列,然后从高到低地相加。加到50%(reads)的时候看看一共包括多少个克隆,克隆数占总数的百分比就是D50值。一个健康 人,因为免疫组库多样性好,免疫细胞总数的50%就会由许多不同的细胞组成,D50值就会偏高;相反,病人常常会有克隆性扩增,免疫多样性差,所以几个克 隆就占据了免疫细胞的50%了,因此D50值就偏低。

专利诉求中除了可以用测序方法做D50计算以外,还提到可以用iCubate仪器通过杂交的方法对D50进行评估。这样就有快速,便宜的方法来“诊断正常”了。


http://blog.sciencenet.cn/blog-290052-405367.html

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