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青蒿素合成生物学发展史
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【新闻背景】
本月25日出版的Nature杂志发表了美国和加拿大两国科学家撰写的研究通信《强效抗疟剂青蒿素的高水平半合成生产》一文，报道了他们一方面将酵母工程菌中青蒿素前体青蒿酸的发酵产量从1.6克/升提高到25克/升，另一方面利用单线态氧成功地将青蒿酸转化成青蒿素。
这项划时代的研发工作始于十多年前，由伯克利加州大学的Keasling领衔，先后以2003年育成紫穗槐二烯合成大肠杆菌和2006年育成青蒿酸合成酵母工程菌为标志，开启了青蒿素合成生物学的新时代。随后，他们利用化学方法实现了青蒿酸向青蒿素的转化（半合成）。目前，Amyris公司正在全面推进青蒿素合成生物学技术的产业化及商业化进程。
我国曾以青蒿素的发现和利用领先于世界，但在青蒿素合成生物学领域却已经大大落后了。假入我们奋起直追，还有希望赶上甚至超越世界先进水平吗？这个问题应该引起我国科研管理部门及学术界研究人员的重视和思考。
【点评】
青蒿素是我国老一辈科技工作者经多年努力于1972 年从传统中草药黄花蒿（习惯称为青蒿）（Artemisia annua L.）中分离提纯的一种具有抗疟功效的倍半萜内酯过氧化物。青蒿素的高生物利用度衍生物青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素等已被广泛用于疟疾临床治疗，疗效确切而且显著，尤其对氯喹抗性疟原虫及致命性脑型疟有效，成为疟疾治疗的一线药物。以青蒿素为基础的联合疗法（ACT）被世界卫生组织（WHO）推荐为治疗抗药性疟疾的首选疗法，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚复方被列入“基本药品目录”。
我国云贵川地区盛产野生青蒿，近年来掀起了青蒿大面积人工种植热潮，但一哄而上的“种植热”造成青蒿素库存猛增，价格一路下跌，从2005 年前的每公斤800-1100 美元跌至2006-2009 年间的每公斤300 美元左右，严重挫伤了农民的种植热情，反过来又造成青蒿素供应链的突然断裂，从而让青蒿素产业发展陷入“生产过剩-种植停顿-供应稀缺”的恶性循环之中。
另一方面，青蒿分布地域狭窄，青蒿素含量偏低（0.01%~0.5%），中国以外地区野生青蒿因青蒿素含量太低而没有商业开发价值，因而无法满足全球抗疟药市场对青蒿素原料药不断增加的采购需求。中国科学院上海有机化学研究所周维善院士研究小组早在1980年代初期就成功地实现了青蒿素的化学合成，为青蒿素提供了一个全新的来源。但是，化学合成青蒿素工艺繁杂，步骤多，成本高，易污染，尤其引入过氧基团的光氧化或化学氧化的产率不理想，导致化学全合成工艺一直无法用于青蒿素的商业化生产。
国内外青蒿素合成生物学研究动态
近年来，国内外分别从青蒿素高产转基因青蒿培育及青蒿素全合成微生物工程菌构建两个方面开展了青蒿素高产应用研究，迄今已取得令人瞩目的成就。
（1）青蒿素高产转基因青蒿的培育
中国科学院植物研究所叶和春教授研究小组最早开展转基因青蒿研究，他们将青蒿素合成途径上游的法呢基焦磷酸合成酶基因（FPS）导入青蒿，通过增大青蒿素合成途径的碳流，获得青蒿素含量比对照高3~4 倍的转基因青蒿发根（0.2%~0.3%）及比对照高2~3倍的转基因青蒿植株（0.8~1%）。我们将反义鲨烯合酶基因（asSQS）导入青蒿，通过阻断青蒿类固醇合成分支途径对青蒿素合成分支途径所需法呢基焦磷酸（FPP）的竞争，获得类固醇含量比对照(0.08%）下降约一半（0.04%~0.05%）及青蒿素含量比对照（0.45%）提高近3 倍（1.23%）的转基因青蒿植株。上海交通大学唐克轩教授研究小组利用发夹RNA 介导RNA 技术抑制青蒿类固醇合成，使转基因青蒿中的青蒿素含量达到3.14%，比对照提高3.14 倍。
青蒿中存在高双氢青蒿酸与高青蒿素的“双高”品系（双氢青蒿酸化学型）和高青蒿酸与低青蒿素的“一高一低”品系（青蒿酸化学型）。收获期青蒿叶片中的双氢青蒿酸含量比青蒿素含量高15-20 倍。目前尚未在转基因青蒿品系中建立将双氢青蒿酸高效转化成青蒿素的技术，导致转基因青蒿的青蒿素高产潜力尚未被充分挖掘。同时，上述高产青蒿素转基因青蒿品系均处于实验室研究阶段，尚未被批准向环境释放，预计走向商业化种植的路还很漫长。
（2）青蒿素全合成微生物工程菌的培育
青蒿与酵母合成萜类前体法呢基焦磷酸的酶促反应完全相同，只要在酵母中增加一个代谢支路就能让酵母菌合成青蒿素。2003年，美国加州大学的Keasling小组将青蒿中克隆的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因（ADS）导入大肠杆菌中表达，同时用酵母萜类合成途径代替大肠杆菌萜类合成途径，首次在微生物体内合成出青蒿素的第一个关键前体——紫穗槐-4,11-二烯。
2006 年，他们又将ADS 基因连同新克隆的细胞色素P450 单氧化酶基因（CYP71AV1）及其还原酶基因（CPR）同时导入酿酒酵母中表达，培育出世界上第一株生产青蒿酸的酵母工程菌。加拿大植物生物技术研究所的Covello小组于2008 年从青蒿中分离到双键还原酶基因（DBR2），并将该基因连同ADS、CYP71AV1、CPR 基因一起导入酿酒酵母，率先培育出能合成双氢青蒿酸的酵母工程菌。
中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所程克棣教授研究小组已培育出高产紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌。我们在大肠杆菌中表达ADS 基因后，检测到与紫穗槐-4,11-二烯相似度为84%的新型倍半萜成分。随后，我们在酵母中表达ADS、CYP71AV1、DBR2基因，不仅检测到紫穗槐-4,11-二烯，还得到各种青蒿素前体，并通过与青蒿无细胞提取液保温而转化成青蒿素。最近，我们又在上述酵母工程菌中导入CPR 和ALDH1 基因，成功获得双氢青蒿酸。然而，目前国内外还没有一个研究小组将酵母工程菌合成的青蒿素前体转变成青蒿素，成为微生物全合成青蒿素必须攻克的最后堡垒！
青蒿素生物合成研究回顾
高等植物及藻类萜类合成途径包括细胞质的甲羟戊酸（MVA）途径和质体的非MVA途径或称甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径。青蒿中特有的青蒿素合成途径是MVA 途径的分支，分支点在法呢基焦磷酸处，包括多步酶促反应（双氢青蒿酸之前）和一步非酶促反应（双氢青蒿酸之后）。首先，ADS 催化法呢基焦磷酸闭环产生紫穗槐-4,11-二烯，然后在CYP71AV1 催化下经连续氧化依次生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，其中青蒿醛在DBR2催化下使Δ11(13)位还原生成双氢青蒿醛，后者再在青蒿醛脱氢酶（ALDH1）催化下氧化生成双氢青蒿酸。双氢青蒿醛与双氢青蒿醇之间也可以互变。
（1）单线态氧催化青蒿素前体转化假说
荷兰瓦格林根大学Bouwmeester小组在青蒿中检测到双氢青蒿酸氢过氧化物，并提出双氢青蒿酸经双氢青蒿酸氢过氧化物形成青蒿素的假说。该假说认为，双氢青蒿酸在单线态氧（1O2）催化下生成的双氢青蒿酸氢过氧化物可在空气中被自动氧化成青蒿素。随后还发现，CYP71AV1 与DBR2 的相对活性决定着紫穗槐-4,11-二烯的去路。如果CYP71AV1 占优势，那么以合成青蒿酸为主；若DBR2 占优势，则以合成双氢青蒿酸为主。
（2）单线态氧催化假说的实验验证
青蒿收获后干燥及重金属、盐胁迫处理青蒿都有利于青蒿素的积累，推测环境胁迫与青蒿素合成有着密切关系，但缺乏直接证据。中国科学院植物研究所叶和春教授研究小组最近发现，用水杨酸处理青蒿，可导致过氧化氢及过氧阴离子爆发，而且它们与青蒿素合成基因表达上调及青蒿素含量增加同步发生。我们研究发现，转基因青蒿植株经过冷处理后，单线态氧的释放比对照植株明显增强，青蒿素含量从对照植株的0.45%提高到转基因青蒿植株的1.23%。冷处理转基因青蒿中的青蒿素含量达到1.66%，而磨碎的转基因青蒿叶片干粉经15 个月贮存后青蒿素含量升至2.35%。我们采用实时荧光定量扩增技术研究了低温、干旱、紫外线辐射、衰老、水杨酸及茉莉酸甲酯等内外环境因素影响下青蒿的诱导表达谱，结果发现青蒿素合成相关mRNA 升高、青蒿素合成酶类增加、青蒿素含量提高与单线态氧释放同步，为单线态氧促进青蒿素生物合成理论提供了直接证据。
（3）内源及外源单线态氧在青蒿素合成中的作用
既然由双氢青蒿酸转变为青蒿素是在单线态氧催化下完成的，那么设法提供外源性单线态氧或诱导细胞内单线态氧发生应能提高这一转变过程的效率。为了阐明外源性与内源性单线态氧在青蒿素合成中的作用，我们在青蒿培养基中添加单线态氧光敏发生剂孟加拉玫红（Rose Bengal）并照光，或在装有青蒿干粉的容器中通入次氯酸钠与过氧化氢反应使其产生单线态氧，发现外源性单线态氧不仅显著降低青蒿素含量，而且导致大量未知产物合成。这可能是由于外源性单线态氧与青蒿素前体可发生非特异性反应，从而导致青蒿素合成碳源相对减少的缘故。我们又利用萜类合成抑制剂洛伐他丁（lovastatin）、磷甘霉素（fosmidomycin）和类胡萝卜素合成抑制剂氟定酮（fluridon）证明，它们均可不同程度地激发叶绿体中单线态氧的释放，通过“逆向信号转导”诱导核内编码的青蒿素合成相关基因表达，并促进青蒿素高产。这些结果表明，单线态氧催化的非酶促反应可能是青蒿素生物合成的限速步骤，只有来源于细胞内而不是细胞外的单线态氧才能催化双氢青蒿酸转变成青蒿素。
为什么微生物不能全合成青蒿素？
酵母工程菌中未检测到青蒿素的原因可能有两个：一是酿酒酵母中单线态氧缺乏，双氢青蒿酸合成后不能转变成青蒿素；二是青蒿素未被油相环境隔离而与细胞成分（如血红素）发生烷基化反应，无法检测到青蒿素。
（1）酵母工程菌不能全合成青蒿素的可能原因
酿酒酵母属于好氧真核生物，其线粒体中呼吸链的电子传递能导致过氧化氢、超氧阴离子等活性氧（ROS）产生，但尚不清楚能否产生单线态氧。据报道，在酿酒酵母中可检测到α-生育酚（维生素E），而红法夫酵母则盛产虾青素（一种类胡萝卜素）。由于α-生育酚和虾青素都是单线态氧淬灭剂，因此推测酵母细胞可能依赖α-生育酚或虾青素等高效清除细胞内的单线态氧，从而导致单线态氧相对缺乏。
青蒿素分子中因存在特有的过氧桥而能分别形成碳自由基和氧自由基，前者能烷化含有血红素的蛋白质或酶而使其失活，后者能氧化脂质及糖类，这些正是青蒿素杀灭疟原虫的关键机制。在巯基存在下，受Fe(III)原卟啉IX 二甲酯催化，青蒿素被激活而产生碳中心自由基，从而与血红素形成配位化合物中间体，再经脱金属作用后生成无过氧桥结构的青蒿素-血红素复合物。
（2）青蒿素-血红素结合物形成的更多实验证据
研究发现，肿瘤细胞中含血红素辅基的酶类（如一氧化氮合酶和过氧化氢酶等）是青蒿素抗肿瘤的分子靶点之一，其机理是青蒿素直接与血红素辅基结合而使酶失活，导致一氧化氮水平降低，过氧化氢水平升高，前者有利于肿瘤细胞存活，后者可促进肿瘤细胞凋亡。在加入60μg/ml 青蒿琥酯后24-96 小时内，肿瘤细胞中青蒿琥酯-血红素结合物的含量不断升高，而血红素的含量不断减少。
同样，在细菌培养基中添加青蒿素，结果发现也能形成青蒿素-血红素结合物，由此可以减少保护性一氧化氮的合成，并增大毒害性过氧化氢的积累，从而大幅度提高细菌对抗生素的敏感性。在加入60μg/ml 青蒿琥酯3 小时后，青蒿琥酯-血红素结合物或血红素含量均为最高，6-9 小时均下降。
最近发现，青蒿素通过抑制诱导型一氧化氮合酶活性及阻遏一氧化氮合成，可阻断小鼠关节滑膜炎的发生。因此，可以推测，双氢青蒿酸即使已被转变成青蒿素，但可能因其与酵母血红素蛋白中的血红素结合成复合物而未被检测出来。这个推论也得到青蒿素可以结合疟原虫体内疟色素的实验结果的支持。
（3）青蒿素合成全过程需要完全隔离的细胞环境
青蒿是如何避免青蒿素对本身的伤害呢？Covello小组的研究显示，青蒿素合成酶基因在青蒿叶片表面具有特殊腺体结构并充满挥发油的腺状毛囊细胞中高效表达，暗示青蒿素生物合成可能发生在腺毛细胞中。
早在多年前就证实，青蒿素对离体培养的植物细胞（包括青蒿培养细胞）具有细胞毒性，而青蒿将“剧毒”的青蒿素隔离在油相腺毛中应该是一种进化的选择。这就是说，青蒿采取细胞分区和分相隔离的方式，合成并贮存具有细胞毒性的青蒿素，可用来杀灭猎食性害虫。同时，青蒿素前体在油相环境中更易发生化学催化反应。香港大学的施丽琼（Sy LK）研究小组给青蒿饲喂同位素标记的双氢青蒿酸并不能得到标记青蒿素，推测只有腺毛的油相细胞环境才能保持青蒿素分子中羟基的稳定性。青蒿全草中的挥发油含量占0.4%，主要包括萜烯类，如石竹烯（丁香烯）、法呢烯、表雪松烯、蒎烯、莰烯、苧烯、月桂烯、甜没药烯等，其中石竹烯环氧化物的含量约占挥发油含量的10%左右。
如何才能实现青蒿素的微生物全合成？
为了寻找酵母工程菌不能全合成青蒿素的可能原因，有人提出酵母菌“单线态氧缺乏”和“青蒿素烷基化”两个假说并进行验证，已得出肯定的结论。
（1）单线态氧缺乏假说和青蒿素烷基化假说的验证
为了验证“单线态氧缺乏假说”，将酵母菌INVScI 菌株培养在YPD 培养基上，采用Pedraza-Chaverri 等报道的方法未测出酵母菌裂解液中的单线态氧释放。为了验证“青蒿素烷基化假说”，将酵母菌INVScI菌株培养在YPD 培养基上，采用Zhang 和Gerhard 报道的方法测得酵母菌裂解液中有青蒿素-血红素结合物存在。
（2）青蒿素-血红素结合物存在于酵母的证据
在加入50μM 青蒿琥酯3 小时后，血红素和青蒿琥酯-血红素结合物均达到峰值，前者表明有血红素蛋白质或酶的诱导合成，后者表明有青蒿琥酯-血红素结合物的形成。另外，500μM 青蒿琥酯作用3-6 小时后，未检测到青蒿琥酯-血红素结合物，表明过高的青蒿琥酯浓度已杀死细胞，因而无血红素合成及青蒿琥酯-血红素结合物形成。
酵母菌细胞色素c 氧化酶（CcO）是一种含有血红素的线粒体酶，假如青蒿素共价结合了CcO 中的血红素辅基，那么必然导致该酶活性迅速受到抑制，并诱导CcO 合成及提高其活性。研究结果显示，在加入不同浓度（0.5mM 和30mM）青蒿琥酯20min后，即可检测到CcO 活性的升高。高浓度青蒿琥酯虽能杀死细胞，但并不影响此前已诱导合成的CcO 的活性。
因此，要让酵母将青蒿素前体直接转化成青蒿素，必须满足两个条件：一是设法让酵母产生内源性单线态氧；二是将青蒿素前体隔离在油相环境中。
青蒿素合成技术路线：全合成还是半合成？
青蒿中的双氢青蒿酸含量比青蒿素含量高10 倍以上，若能建立青蒿素前体的高效转化新工艺，即可促进青蒿“下脚料”中青蒿素前体的再利用，最大限度地节约青蒿资源。据测定，青蒿植株中的青蒿素含量比双氢青蒿酸含量低5-10 倍，最大可相差15 倍！
若将提取青蒿素后剩余的植物材料或样品中的双氢青蒿酸重新加以利用，则相当于多种植了15 倍数量的青蒿植株或节约了15 倍面积的耕地。那么，如何将青蒿素前体转变成转变成青蒿素呢？从目前来看，可行的方案有两个，一是化学途径，二是生物学途径。国内外已有3 个研究小组分别建立了青蒿素前体的化学转化技术。
（1）由青蒿酸转变成青蒿素
在Bill & Melinda Gates基金会提供的5年期共4260万美元巨额赞助下，由One WorldHealth非赢利组织主导，在Amyris Biotechnologies公司和Sanofi-Aventis公司参与下，美国伯克利加州大学Keasling研究小组会同加拿大植物生物技术研究所Covello研究小组，于2004年启动了以高产青蒿素酵母工程菌构建为目标的“青蒿素项目”（The ArtemisininProject），该项目实施至今已获得产青蒿酸及双氢青蒿酸等青蒿素前体的基因工程酵母菌。
在此基础上，他们以酵母工程菌生产的青蒿素前体为原料，采用化学方法半合成青蒿素，并且已启动产业化进程。Amyris Biotechnologies公司采用化学方法将大肠杆菌及酵母合成的青蒿酸转化成青蒿素，但由于涉密而未公开其技术路线及生产工艺。最近，该公司又发表了由紫穗槐二烯化学合成双氢青蒿酸的技术路线。据最新消息，目前法国Senofi公司已利用酵母工程菌发酵生产出青蒿酸39吨，经化学半合成青蒿素后，相当于4000万份疟疾用药。该公司计划在2014年底前生产出60吨青蒿酸。
（2）由双氢青蒿酸转变成青蒿素
2012年1月17日德国出版的Angewandte Chemie发表了德国马普研究所、柏林自由大学
Seeberger小组的最新研究成果，他们利用离体光化学催化法已将双氢青蒿酸转变成青蒿
素。该催化过程包括两步反应，第一步生成羧化的双氢青蒿酸中间产物，第二步由羧化双
氢青蒿酸转变成青蒿素，产率为46%。
据国内媒体报道，我国上海交通大学张万斌团队近期在青蒿素前体的化学转化研究中取得重大突破，他们将青蒿酸还原后获得的双氢青蒿酸经过一个无需光照的常规合成途径，成功获得氧化双氢青蒿酸，经分子内重排即可获得青蒿素。
国外利用酵母工程菌生物合成青蒿酸及化学半合成青蒿素的生产工艺已经基本成型，而我国尚未育成类似的青蒿酸生物合成工程菌，即使拥有青蒿酸化学半合成青蒿素技术，也暂时无法派上用场。另一方面，鉴于生物转化效率高、成本低、污染少等优势，我们可以尝试用生物转化法替代化学转化法，即通过单线态氧发生酵母菌与双氢青蒿酸提取液混合发酵的方法进行青蒿素的生物半合成，将提取青蒿素后剩余的双氢青蒿酸转化为青蒿素。然而，国内外目前还没有建立双氢青蒿酸合成青蒿素的生物转化技术。
青蒿素是中国人首先发明并最早投入生产应用的“国宝级”天然药物，它的问世不仅控制了疟疾在我国的流行，而且为世界贫穷地区的疟疾患者解除了疾苦。我们能否在青蒿资源工程研究尤其是青蒿素前体转化技术上抢占先机，为全球的健康事业做出更大的贡献，必须依靠我国政府的鼎力支持及本土科学家们的共同努力！
屠呦呦获拉斯克奖
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