测序流程

1.     DNA样本检测

DNA样本检测主要有两种方法:

1)    琼脂糖凝胶电泳：检测是否降解，是否有杂质；

2)    nanodrop检测：质量量化。

要求：浓度>=20ng/ul, 总量>800ng

2.     文库构建

将基因组DNA用Covaris破碎仪随机打断成180-280的片段，使用Agilent SureSelect Human All Exon V5/V6 试剂盒进行末端修复、磷酸化以及加polyA，片段两端分别连接接头制备DNA文库。带有特异 index 的文库与多达 543,872 个生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将 20,965 个基因 的 334,378 个外显子捕获下来，经 PCR线性扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。

3. 库检

文库构建完成后，先使用Qubit 2.0 进行初步定量，随后使用Agilent 2100 对文库的 Insert size 进行检测，Insert size 符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度（3nmol/L）进行准确定量，以保证文库质量。

4. 上机测序

库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行 Illumina HiSeq PE150 测序。PE150（Pair End 150 bp）指高通量双端测序，每端各测150 bp。在构建的小片段文库中，Insert DNA，即插入片段是高通量测序直接测序的单位。双端测序是将每条插入片段的两端进行测序的方法，由于插入片段的长度分布已知，双端测序时不仅可以知道片段两端的序列，也能知道这两段序列之间的长度，从而便于后续比对分析。