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霉酚酸和IMD-0354对SARS-CoV-2的抗病毒活性

已有 466 次阅读 2020-6-30 15:48 |个人分类:读后感|系统分类:论文交流| 霉酚酸, IMD-0354, SARS-CoV-2, 抗病毒活性

霉酚酸和IMD-0354SARS-CoV-2的抗病毒活性

本文为读后感,原文见文后,读后感作者张楚

摘要:本研究分析了霉酚酸(MPA)IMD-0354的抗SARS-CoV-2活性,并根据其抗其他冠状病毒的活性进行了筛选。由于它们还能抑制登革病毒(DENV)感染,因此也对其他抗DENV化合物/药物进行了评估。利用SARS-CoV-2感染的VeroE6/TMPRSS2细胞,MPA和IMD-0354显示出显著的抗SARS-CoV-2活性,而其他抗DENV化合物/药物则未显示出明显的抗SARS-CoV-2活性。虽然MPA仅使病毒RNA水平降低约100倍,但其EC50低至0.87μM,这在霉酚酸酯治疗剂量下很容易实现。MPA以冠状病毒类木瓜蛋白酶为靶标,其研究将有助于抗SARS-CoV-2新药的开发。

 

新冠肺炎疫情于2019年12月在中国武汉爆发,迅速蔓延至全球。3月11日,世界卫生组织宣布新冠肺炎为大流行,以强调全球应对这种疾病的迫切必要性。由于没有药物和疫苗,因此迫切需要开发。在本研究中,作者检测了霉酚酸(MPA)和IMD-0354对SARS-CoV-2的抗病毒活性。以往的研究表明,MPA对MERS冠状病毒、人冠状病毒OC43、HCoV-NL63和小鼠肝炎病毒(MHV)有抗病毒活性IMD-0354对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)有抗病毒活性。作者之前已经证明MPA和IMD-0354对登革病毒(DENV)也显示出抗病毒活性。

 

本研究采用简单的细胞病变效应观察法(CPE法)作为病毒生长的指标,粗略评价单个化合物/药物对SARS-CoV-2感染的抗病毒活性。该方法是基于最近发现的VeroE6/TMPRSS2细胞对SARS-CoV-2感染具有高度的敏感性和强烈的CPE而建立的。将SARS-CoV-2和不同浓度的单个化合物/药物混合并加入到VeroE6/TMPRSS2上。由于强烈的CPE,感染的细胞从培养板上脱落,几乎检测不到结晶紫染色。如果化合物/药物显示抗病毒活性,单层仍然附着,结晶紫染色仍然清晰可见。结果表明,用适当浓度的IMD-0354或7种抗DENV的化合物(CCT08159、PD102807、CD437、维甲酸、吲哚青碱、马普替林和喹啉)处理细胞后,细胞仍保持清晰可检测的结晶紫染色。然而,在高浓度化合物/药物处理的细胞中观察到较差的结晶紫染色,可能是由于细胞毒性。(Fig.1)蓝条表示病毒CPE被阻断的最低药物浓度水平,以及结晶紫染色后细胞保持附着的最低药物浓度水平(抗病毒水平)。红条表示药物的最低浓度水平,在该浓度水平下,药物表现为细胞毒性,结晶紫染色较差(细胞毒性水平)。这些结果表明,CCT08159、CD437、吲哚青碱、马普替林和喹卡林的有效浓度范围(蓝条和红条之间;图1)较窄,显示出低细胞毒性的抗病毒活性。因此,这五种化合物/药物的抗SARS-CoV-2活性仍不确定。MPA在CPE实验中未显示抗SARS-CoV-2活性。另一方面,IMD-0354和另外两个化合物(PD102807和维甲酸)具有明显的抗SARS-CoV-2活性,但PD102807和维甲酸完全抑制CPE所需的药物浓度较高(32μM)。因此,CPE试验表明IMD-0354可能是抗sars-cov-2药物的候选药物。

 

 

 

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图1: CPE试验。将SARS-CoV-2Wk521株(12株)与V-eroE6/TMPRSS2细胞单层细胞在含不同浓度药物的培养基中培养50h(MOI=0.01)。50h孵育后,细胞单层结晶紫染色。蓝条表示病毒CPE被阻断的最低药物浓度水平,以及结晶紫染色后细胞保持附着的最低药物浓度水平(抗病毒水平)。红条表示药物的最低浓度水平,在该浓度水平下,药物表现为细胞毒性,结晶紫染色较差(细胞毒性水平)。

 

接下来,为了定量评价这些化合物/药物的抗SARS-CoV-2作用并计算其EC50,采用与上述CPE方法相同的实验条件,分析细胞内SARS-CoV-2RNA的水平。在CPE试验中,每个图表(图2)中红色条上方的化合物/药物浓度表示细胞毒性。在CPE试验中,每张图中蓝色条上方的化合物/药物浓度显示出抗SARS-CoV活性。因此,每个图形中的浅紫色区域表示有效化合物/药物浓度范围,相当于CPE检测中的均一结晶紫染色。经IMD-0354和CCT08159、PD102807、CD437、维甲酸、吲哚青碱、马普替林和喹啉等7种已鉴定的化合物/药物处理后,病毒RNA水平降低了10,000倍以上,与CPE检测结果一致。病毒RNA和CPE检测数据表明,要将病毒RNA减少到100倍(低于106拷贝),才能将CPE抑制到足以保持细胞附着的水平。MPA在SARS-CoV-2复制中抑制100倍,但在高浓度MPA抑制水平低于100倍的情况下,仍可观察到CPE(图1和图2)。重要的是,在所有测试的化合物/药物中,MPA的EC50(图2中的绿色虚线)最低(0.87μM)。吲哚青碱和IMD-0354在中高浓度对SARS-CoV-2表现出很强的抑制活性,在所测试的化合物/药物中显示出第二和第三低的EC50(分别为1.57μM和1.74μM)(图2)。


 

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图2:药物对病毒RNA合成的影响。将SARS-CoV-2Wk521株(12株)与V-eroE6/TMPRSS2细胞单层细胞在含不同浓度药物的培养基中培养50h(MOI=0.01)。孵育50h后,从培养液中提取RNA,逆转录定量PCR检测SARS-CoV-2特异性RNA,如上所述。蓝条和红条分别表示抗病毒水平和细胞毒性水平,如图1所示。

 

本研究表明IMD-0354对SARS-CoV-2复制有抑制作用。IMD0354是一种IKKβ抑制剂,可阻断I-κBα磷酸化和NF-κB活化。虽然NF-κB被冠状病毒感染激活,刺激促炎细胞因子和趋化因子的产生,并促进冠状病毒的发病,但由于NF-κB是宿主天然免疫反应的关键转录因子,而冠状病毒本身又抑制NF-κB介导的途径,因此其抑制冠状病毒感染的机制尚不清楚。此外,在这项研究中,使用VeroE6/TMPRSS2细胞对Ⅰ干扰素相关基因缺失的IMD-0354进行了评估。IMD-0354具有一定的抗病毒活性,其作用机制可能与此无关。因此,IMD-0354抑制冠状病毒的潜在机制有待进一步研究。

MPA是一种肌苷一磷酸(IMP)脱氢酶抑制剂,在嘌呤生物合成中起关键作用。FDA批准的两种药物,咪唑立宾和霉酚酸酯都是衍生物。本研究显示MPA具有抗SARS-CoV-2的活性,与已报道的抗MERS-CoV的活性相似。以前的研究表明MPA抑制MERS-CoV木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro),该酶对病毒的非结构多蛋白进行蛋白水解以使其成熟。PLpro还有助于通过去泛素化来逃避宿主的先天免疫,干扰素调节因子3与抑制β干扰素(IFN-β)诱导。重要的是,对于MERS冠状病毒感染,MPA表现出低的EC50,在治疗剂量下很容易达到。因此,本研究建议将MPA与干扰素-β联合应用于临床治疗MERS冠状病毒,从而提高MPA的疗效。霉酚酸酯可以口服,MERS患者的临床和实验室研究结果表明,在他们的治疗中使用霉酚酸酯可以提高存活率。重要的是,在细胞培养和体内(小鼠)实验中,MPA几乎没有抑制SARS-CoV感染的作用。我们的CPE实验也未能检测到MPA的抗SARS-CoV-2作用,因为即使在高浓度MPA的抑制作用也不是很理想。然而,值得注意的是,MPA的EC50低至0.87μM,远低于霉酚酸酯治疗期间所达到的MPA血清水平。因此,类似于中东呼吸综合征冠状病毒的病例,值得考虑FDA批准的霉酚酸酯与其他有效药物联合治疗新冠肺炎的临床应用。

综上所述,本研究证实了MPA和IMD-0354的抗SARS-CoV-2活性。当SARS-CoV-2复制减少100倍以上时,我们的CPE法可以简便有效地用于抗SARS-CoV-2化合物/药物的筛选。IMD-0354具有较强的抑制作用,EC50较低(1.74μM)。虽然MPA对SARS-CoV-2复制的抑制水平不到100倍,但在低浓度下(EC50=0.87μM)表现出明显的抗SARS-CoV-2活性,这一水平很容易通过霉酚酸酯的治疗剂量达到。MPA具有抑制冠状病毒PLpro的作用,对MPA的进一步研究将有助于开发新型的抗SARS-CoV-2药物。

 

 

原文:doi: 10.1111/1348-0421.12828

原文:Antiviral activities of mycophenolic acid and IMD-0354 against SARS-CoV-2 



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