简要：使用MARCM技术可以在果蝇活体内正向标记基因突变的细胞（positively labeling mutant cells）。它基于两项已有的技术：FLP/FRT和UAS/Gal4/Gal80。MARCM技术自1999年问世以来，在果蝇神经发育生物学领域起到了举足轻重的作用。这是两位华人科学家Tzumin Lee与Liqun Luo的杰作。

现代的遗传发育学领域虽然五花八门，有些令人眼花缭乱，但基本的指导思想也很简单：在活体动物里增加、减少、或敲除一个或多个基因，继而研究这些基因在体内的生理功能。所以遗传发育学的基本工具分为两大类：一类是让基因表达量提高，另一类是让基因表达量降低或消失。

大部分有重要功能的基因，无论是提高表达，还是敲除，都会导致胚胎期致死。对于关注胚胎后发育的研究者来说，这是一个必须解决的问题。这个问题的解决办法就是制造“嵌合体”（mosaic clone）。“嵌合体”指的是，在生物体中，大部分细胞是正常细胞，个体可以基本正常生长发育，而只有体内的一部分细胞的基因被改变，或者升高，或者降低。这些被改变的细胞群，就称为嵌合体。

在果蝇研究中，如果想在嵌合体中增加基因表达，用UAS/Gal4系统；如果想在嵌合体中敲除基因，用FLP/FRT系统。

UAS/Gal4

在UAS/Gal4系统中，Gal4是来源于酵母的转录因子，而UAS则是其结合调控的DNA序列。因为果蝇基因组不编码Gal4转录因子，所以在果蝇体内过量表达Gal4，不会对果蝇发育产生显著影响。同理，在果蝇体内插入UAS-gene（UAS下游连接着一个待表达的基因）片段，也不会对果蝇产生影响，因为野生型的果蝇没有Gal4转录因子，不能激活UAS。所以，单独含有Gal4或者UAS-gene的果蝇是发育正常的。但如果让这两个果蝇杂交，产生的后代的基因组中同时含有Gal4和UAS-gene，这样，在Gal4的调节之下，这个gene的表达量就会提高 （如下图）。

http://www.clas.ufl.edu/jur/200312/papers/paper_lanata.html

这个gene在哪里表达，在什么时候表达，表达多少，要取决于Gal4的表达水平和时空特性。Gal4的表达水平可以通过不同的增强子来调节。在果蝇研究过程中，研究者收集了很多“增强子-Gal4”，可以让其在某个器官里表达，在某一群特定的细胞里表达，也可以在一个特定的细胞里表达。

Gal80也是来源于酵母的一个蛋白，它可以抑制Gal4的活性。Gal80与Gal4相比，被利用的频率要低得多，但有时候会很有用。以下要描述的MARCM技术，就是妙用了Gal80。

FLP/FRT

UAS/Gal4这个来源于酵母的系统可以特异地提高果蝇的基因在体内的表达量，在嵌合体细胞内敲除某个基因的FLP/FRT技术也是来源于酵母。

果蝇有分裂能力的细胞都是双倍体细胞，含有四对染色体，每对染色体中的一条被称为同源染色体，分别来自于母本和父本，它们的基因背景是不一样的。在正常的细胞分裂中，果蝇的一对同源染色体总是能忠诚地复制，然后分配到新分裂的细胞中（如下图）。

FLP是一个来自酵母的染色体重组酶，而FRT则是FLP催化的一段DNA序列。如果把FLP和FRT通过转基因导入果蝇基因组中，在FLP的催化下，含有FRT序列的同源染色体会在细胞分裂过程中产生重组。同源染色体重组的结果是：两个后代细胞含有一段只来自于母本或父本的染色体（如下图，比较红圈部分），而不像其他为重组的细胞，一边来自母本，另一边来自父本（如上图）。

这种同源染色体重组有什么用呢？用处大得很！如果两条染色体中的一条是正常的，而另一条染色体上的感兴趣基因被突变掉，那么对于绝大部分没有重组的细胞来说，它们是“杂合体”。这些杂合体细胞在绝大部分情况下是正常的，所以果蝇也是基本正常的。对于那些发生同源染色体重组的细胞来说，它产生的两个子细胞中，一个含有双份正常染色体的细胞，而令一个则是含有双份突变染色体的细胞。如果我们在正常染色体上添加标示（例如眼睛颜色，或者GFP），那么，可以在果蝇器官或组织中观察突变细胞的表型变化（如下图，在果蝇幼虫期眼睛皮层中，有GFP的为正常细胞，没有GFP的为突变细胞）。

Wu et al., 2003

MARCM

Gal4/UAS可以让基因升，FLP/FRT可以让基因降，而且可以选择性地在特定的细胞里做这些操作。这两个一阴一阳的技术让果蝇遗传学变得很潇洒。但这里面还有“一朵小黑云”，那就是FLP/FRT只局限于在二维的皮层细胞里操作。因为这项技术所标记的细胞是正常细胞，而突变细胞没有标记，如果想看清楚突变细胞，需要组织器官里的细胞很有规律地排列。对于那些具有复杂细胞形态的组织，例如神经组织，我们很难在众多的表达GFP的正常细胞中分辨出那些突变的细胞。

这个问题可能最先由做果蝇神经生物学的人提出来，也由他们来回答了。Tzumin Lee与Liqun Luo在1999年发表了一篇文章，介绍一种可以用GFP标记突变细胞的方法，称为MARCM （mosaic analysis with a repressible cell marker）。这个名字表达了两个含义：1）这是一项基于FLP/FRT的嵌合体技术（mosaic analysis）；2）标记嵌合体细胞的方法有些特别，因为用的是a repressible cell marker。MARCM的原理图如下：

http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n6/full/nprot.2006.320.html

如上1)所说，MARCM技术包含FLP/FRT，通过同源重组，产生嵌合细胞。为了正向而不是反向标记这些细胞，他们在感兴趣的正常染色体上插入Gal80，同时，在其他区域插入Gal4/UAS-GFP。在正常细胞中，Gal80/Gal4/UAS-GFP在一起，细胞不表达GFP。但一旦FLP/FRT产生嵌合体细胞，有一个细胞含有两份Gal80，不会表达GFP，这是正常细胞；另一个没有Gal80，表达GFP，是感兴趣的嵌合体细胞。如果在不含Gal80的染色体上引入突变（如上图中的星号），那么MARCM技术就能让突变细胞表达GFP，而其余正常细胞则没有GFP。下图是他们把MARCM技术用于神经系统的一个例子：

Lee and Luo, 1999 左边为正常神经细胞，右边为突变细胞。

上图显示，正常神经元与突变神经元表现出来的形态很不一样。有了这项技术，可以深入研究基因如何调控神经元存活、形态变化、迁移等等重要的问题。

MARCM技术不但在基因-神经元领域打开了新天地，它也给做其他方向的人提供了一种选择。除了正向标记突变细胞，还可以利用MARCM技术在突变细胞里同时表达别的基因，把loss-of-function与gain-of-function很好地结合起来。这样的例子很多，其中的一个有趣的例子是用于癌基因的研究。

癌基因大概分为两大类：原癌基因（proto-oncogene）和抑癌基因（tumor suppressor）。在癌细胞中，前者活性上升，后者降低。癌症被认为是多个癌基因突变诱发的。Ras是一个重要的原癌基因，而scrib则是一个抑癌基因。只让Ras的表达量升高（下图中左），与正常对照相比（下图左），细胞多了一点；只让scrib突变，细胞数目反而有所下降，因为scrib突变会导致细胞死亡（下图中右）；但如果Ras上升+scrib突变，细胞数目增加，并且从原来的位置迁移到了其他地方（下图右）。这是利用果蝇研究癌基因的一个成功的例子。

Pagliarini and Xu, 2003 

Lee & Luo发明的这项MARCM技术综合了两个已有的技术，是站在巨人肩膀上的一个进步。但这项其貌不扬的技术产生了很大的能量，让果蝇领域以及神经发育领域的人多了一个很有力的工具，可以回答很多以前不能回答的问题。Luo实验室还把MARCM技术推广到了小鼠。但小鼠的遗传学工具与果蝇有很大差别，要把小鼠MARCM做得随心所欲，还有很多技术问题需要解决。

在做这个工作的时候，Lee是博士后，Luo刚刚当上老板。他们现在都是响当当的人物，大家感兴趣可以搜一下，第一个结果肯定是你想要的。