1. 蛋白质结晶（Crystallizing a Protein）

1.1 引言（Introduction）

当别人在谈论傅立叶和帕特森，或者分子置换及分子动力学改良时，新到蛋白质X射线晶体学实验室的同学们可能会迷惑。然而，他们立即会明白要想确定蛋白质的结构，首先必须生长出合适的晶体。没有晶体，便谈不上用X射线确定蛋白质结构。这一章，我们讨论蛋白质晶体生长的原理。作为实践，我们将给出结晶溶菌酶的方法。我们还将得到一个溶菌酶晶体的X射线衍射图像，这将提供对X射线衍射的简介。这一章包括一个关于常见问题的讨论。

 

 

1.2 蛋白质结晶原理（Principles of Protein Crystallization）

蛋白质的X射线结构分析首先要获得合适的单晶。蛋白质结晶学尚未发展成熟，尽管很受人亲睐，特别是受航天飞机中微重力实验 (Kundrot et al., 2001; McPherson et al., 1995) 的激发。蛋白质结晶是一个反复试验的过程，蛋白质逐渐会从溶液中析出，杂质、晶核及其他未知因素对此过程有所影响。通常，蛋白质越纯，生长晶体几率越大。蛋白质结晶学者对蛋白质的纯度要求要严于生化学家的要求，后者往往在酶催化活性足够高时就很满意。另一方面，为了使蛋白质结晶，不仅要加其他成分，所有蛋白质分子的表面性质也必须是相同的，特别是表面的电荷分布，因为它影响晶体内分子的聚集。质谱是蛋白质结晶中的一种有效工具，例如检测重组蛋白的表达、样品纯度、重原子衍生物及蛋白质结构的特性(Cohen, 1996; Potier et al.,2000)。

蛋白质结晶涉及四个重要步骤如下：

1.       蛋白质纯度的确定。如果不够非常纯，必须要进一步纯化。

2.       蛋白质溶解于合适的溶剂中，从中它能通过一种盐或有机化合物而析出。溶剂通常是水-缓冲剂溶液，有时加有机溶剂，如2-甲基-2，4-戊二醇（MPD）。正常情况下，沉淀剂也被加入，但是浓度不高于使沉淀产生。对于不溶于水-缓冲剂或水-有机溶剂的膜蛋白，还需要加入去污剂。

3.       使溶液过饱和。在这一步中，小聚集体形成，它是晶体生长所需的核。对小分子的结晶来说，相比于蛋白质更为人熟知，晶核的自发形成需要提供表面张力能。一旦这个能障被突破了，晶体开始生长。能障在高水平的过饱和度时很容易克服。因此，在高过饱和度时，晶核更易自发形成。晶核的形成可作为一个过饱和度和其他参数的函数通过多种方法来研究，包括光散射、荧光去极化及电子显微镜。

4.       一旦晶核形成，晶体生长正式开始。对低分子量的化合物而言，新分子会逐步结合到正在生长的晶体表面。这是由于这些位置的结合能比较大，相对于分子结合到平滑的表面。这些步骤要么由晶系缺陷造成，要么发生在表面随机形成的晶核。

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