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单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(应用篇一)

已有 1099 次阅读 2019-10-20 18:08 |系统分类:科研笔记

编者按:本文是Illumina团队出的NGS技术在单细胞研究中的应用,坊间以pdf的形式传阅,余以为多有不便,今摘抄于此。版权归原作者所有,侵删,内容仅供学习,更多详细信息请阅读原文。由于是综述文章,引用较多,这里为放方便阅读见,从略。

简介

活组织由多种细胞类型组成。每种细胞类型都有不同的谱系和独特的功能,对组织和器官生物学产生影响,并最终定义机体整体的生物学功能。每个细胞的谱系和发育阶段决定细胞如何对其他细胞以及其天然环境应答。此外,相同类型细胞的亚群之间以及它们与其他细胞类型之间通常具有遗传异质性。 最近,科学家们启动了雄心勃勃的人类细胞图谱计划,这是一项国际合作,致力于利用单细胞测序定位人体中的所有细胞类型。

单细胞测序已成为一种革命性的方法,它以前所未有的分辨率和规模揭示了生物学过程,对生物学和医学产生了重大影响。——Benitez 等,2017年

单细胞组织测序的主要动力来源于癌症研究,其中细胞谱系和残留疾病的检测至关重要。当前,单细胞方法还用于提升我们对其他复杂生物系统的理解,包括中枢神经系统(CNS)、免疫系统和哺乳动物发育。

单细胞测序还是鉴定在体外难以培养的机体的有效方法。

单细胞测序的发展已提高了对传染性疾病、食源性病原体和肠道环境中微生物多样性的检测和分析。

新一代测序(NGS)的高度准确性和特异性使其成为单细胞和低水平DNA/RNA测序的理想工具。单细胞技术日益增多,已发布的单细胞技术包括DNA突变、拷贝数变异(CNV)、DNA– 蛋白质结合、RNA 剪接检测和 mRNA 表达测定。最近,微流体平台和基于液滴的方法,使得大量单个细胞的mRNA大规模平行测序成为可能。单个细胞的功能在很大程度上取决于其与相邻细胞的相互作用。单细胞测序实验中通常缺少此空间信息,但新的方法 和分析算法将单细胞基因表达的测量与组织内的空间定位结合了起来。

本综述着重于近期发表的文献,展示了如何将Illumina技术用于单细胞测序应用和技术。了解更多有关 Illumina 测序和芯片技术的信息,请访问 www.illumina.com。

应用

癌症
驱动突变经过肿瘤亚克隆的连续克隆扩张达尔文选择,进而导致肿瘤进展。因此,晚期肿瘤可能含有大量独特的亚克隆,带有不同的变异组、不同的组织病理学,对治疗具有不同的反应。 诊断时对所有亚克隆进行分子分析非常重要,因为仅占原发性肿瘤0.3%的亚克隆可能会在复发后成为优势克隆。 深度测序可检测低至总肿瘤细胞群1%的亚克隆丰度,但需要单细胞测序法罕见细胞群上对治疗效果进行充分鉴定。

理解在个体水平以及整体水平单个癌细胞一定会推动我们对治疗耐受性以及肿瘤生物学各个方面的理解。——Baslan 和 Hicks,2017年

循环肿瘤细胞(CTC)还可用于检测癌症。 游离癌症核酸标志物检测——也称为液体活检——可更具敏感性和重复性。 用于癌症干细胞(CSC)和播散癌细胞分子分析的单细胞方法也增加了我们对肿瘤发展、转移和治疗反应的理解。

近期临床资料已表明免疫系统功能的治疗性增强可提高癌症预后。 阻断细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)的抗体和程序性死亡受体-1(PD-1)在大量癌症中诱导临床反应,包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤。 单细胞测序法使我们有可能更深入地了解免疫细胞和肿瘤细胞之间复杂的相互作用,更彻底地鉴定肿瘤的细胞学生态体系。

  • Chung W, Eum HH, Lee HO, et al. Single-cell RNA-seq enables comprehensive tumour and immune cell profiling in primary breast cancer. Nat Commun. 2017;8:15081

单细胞方法表明,肿瘤具有遗传异质性。在本研究中,作者使用HiSeq ™    2500系统对从乳腺癌肿瘤中分离出的515个单个细胞进行了RNA-Seq。单细胞转录组分析确立了亚型特异性乳腺癌细胞的异质性及其保守的基因表达特征。除了乳腺癌细胞,作者还鉴定了T细胞、B细胞和巨噬细胞的基因表达特征。单个T细胞包括激活T细胞和耗竭T细胞两类,这表明免疫细胞与肿瘤间的相互作用动态性且各异。这些数据表明,各个乳腺癌肿瘤微环境中包含的细胞都具有独特的基因表达模式,肿瘤亚型由肿瘤微环境内的肿瘤细胞和与免疫细胞共同决定。

Illumina的技术:Nextera™    XT    DNA    Sample    Prep    Kit、TruSeq™    Rapid    SBS    Kit、HiSeq    2500 系统

  • Giustacchini A, Thongjuea S, Barkas N, et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nat Med. 2017;23:692-702

癌症干细胞是某些肿瘤中存在的罕见细胞类型,具有正常干细胞的特征,能形成肿瘤。此外,癌症干细胞可耐受化疗,在缓解期时仍可存留。由于组织细胞的数量远多于癌症干细胞,并且癌症干细胞难以分离,因此从遗传上鉴定癌症干细胞极具挑战性。在本研究中,作者利用单细胞转录组分析对慢性粒细胞性白血病(CML)中的癌症干细胞进行了鉴定。CML的典型特征是存在BCR-ABL 融合基因,相较于其他癌症,在遗传上不那么复杂。作者结合 HiSeq    2000/4000 系统的 RNA 测序,开发了单细胞实验方案以提高对BCR-ABL 的检测。随后,他们对2000多个来自CML样本的单个干细胞进行了RNA-Seq。他们的数据揭示了CML癌症干细胞的异质性,并确立了与CML治疗反应不佳有关的基因表达特征。最后,他们的数据表明,CML诊断中已有的癌症干细胞基因表达特征导致了对化疗的耐受性。

Illumina的技术:Nextera    XT    DNA    Sample    Preparation    Kit、HiSeq    2000/4000系统

  • Lavin Y, Kobayashi S, Leader A, et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 2017;169:750-765 e7172

检查点阻断癌症免疫疗法通过改变宿主T细胞的功能发挥作用,对晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗具有重要影响。肿瘤浸润性骨髓细胞是向宿主T细胞呈递肿瘤相关抗原的宿主免疫细胞,影响着肿瘤进展和治疗反应。但是,目前仍缺乏对免疫系统如何应答肿瘤信号的详细了解。为解决这一知识缺口,作者对来自NSCLC患者肿瘤、非癌性肺组织和血液的免疫细胞进行了单细胞分析。他们发现,肿瘤中的免疫细胞数量多于非肿瘤肺组织。此外,在早期肺肿瘤中,T细胞和B细胞富集,而自然杀伤(NK)细胞显著减少。此外,作者利用单细胞RNA测序发现了早期NSCLC中肿瘤浸润性单核细胞的遗传多样性,并确立了这些单核细胞类型在 NSCLC 不同阶段的基因表达特征。

  • Levine MS, Bakker B, Boeckx B, et al. Centrosome Amplification Is Sufficient to Promote Spontaneous Tumorigenesis in Mammals. Dev Cell. 2017;40:313-322 e315

中心体是动物细胞中主要的微管组织中心以及细胞周期进程的调控因子。在正常细胞中,每个细胞周期中心体仅复制一次,其中一个拷贝在有丝分裂中传给子细胞。但是在癌细胞中,额外的中心体很常见;它们与不良预后和染色体数量异常即非整倍性有关。目前,对于额外的中心体是否会导致癌症,或者其仅仅是因肿瘤发生而增多尚不明确。为解决这一问题,作者构建了中心体复制调控基因Plk4过表达的转基因小鼠。这些转基因小鼠多种组织细胞中的中心体数量持续增加。然后,作者使用HiSeq    2500系统,利用单细胞基因组拷贝数分析对99个单个表皮细胞进行了核型分析。他们的数据表明,中心体扩增足以引起转基因小鼠细胞中的染色体分离错误和非整倍性。此外,从36周开始,Plk4转基因小鼠发生了自发性的非整倍性肿瘤。总之,这些数据表明,中心体扩增足以引起小鼠的非整倍性和癌形成。

Illumina的技术:TruSeq    DNA    Sample    Preparation    Kit    v2、HiSeq    2500系统

  • Venteicher AS, Tirosh I, Hebert C, et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 2017;355:eaai8478

单细胞测序法可用于分析肿瘤细胞的遗传多样性以及鉴定肿瘤微环境。但是,已经有许多来自大型群体的批量数据,例如癌症基因组图谱计划(TCGA) 。在本研究中,作者结合了来自16个异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变型胶质瘤的 14,266 个细胞的单细胞 RNA-Seq 与 165 个 TCGA 批量 RNA 表达谱。TCGA    RNA 数据表明了IDH突变型胶质瘤的2个不同亚型星形胶质细胞瘤和少突胶质细胞瘤中的基因表达差异。单细胞RNA-Seq表明,基因表达差异是由特征肿瘤事件和肿瘤微环境组成所致。值得注意的是,两种胶质瘤亚型中的胶质细胞系相似。此研究证明了单细胞和RNA-Seq方法相结合的威力,其数据为IDH突变型胶质瘤的遗传组成带来了新的见解。

Illumina的技术:Nextera    XT    Library    Prep    Kit、NextSeq™    500 系统

  • Zheng C, Zheng L, Yoo JK, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 2017;169:1342-1356 e1316

肝细胞癌(HCC)是全世界癌症死亡的主要原因,在亚洲和非洲的发病率最高。虽然癌症免疫疗法为其他肿瘤类型带来了希望,但其在HCC治疗上仍未取得成功,尽管HCC肿瘤含有高水平的肿瘤浸润性单核细胞。在本研究中,作者利用单细胞RNA-Seq,试图了解和鉴定HCC中的肿瘤浸润性单核细胞。具体来说,他们从6个HCC样本的外周血、肿瘤和邻近的正常组织中分离了5000多个T细胞。然后使用HiSeq    2500/4000系统对单个T细胞进行了深度RNA-Seq以及T细胞受体(TCR)测序。结合单细胞转录组谱和TCR序列,鉴定了11个不同的T细胞亚型。值得注意的是,作者发现,耗竭的CD8+T细胞和Tregs 细胞在HCC中富集
并克隆扩增。此研究证明了单细胞测序法在鉴定 HCC 肿瘤微环境和肿瘤浸润性细胞的特征中的用途。

Illumina的技术:HiSeq    2500/4000系统

  • Tirosh I, Izar B, Prakadan SM, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science. 2016;352:189-196

单细胞测序可通过评估肿瘤内的恶性程度、微环境和免疫状态提供治疗反应和耐药性信息。在本研究中,作者对从19位患有转移性黑色素瘤患者分离出的4645个单细胞(恶性的、间质的、免疫的、内皮的)进行scRNA-Seq。该研究发现同一肿瘤内的恶性细胞显示出与细胞周期、空间关系和耐药性相关的转录异质性。同一肿瘤包含具有小眼畸形相关转录因子(MITF)高表达水平的细胞,以及具有低MITF水平和AXL激酶水平升高的细胞(易于发生早期耐药性的细胞)。浸润的T细胞分析揭示了排除程序、与T细胞活化/扩张的联系和患者变异性。本研究阐明了单细胞基因组如何能揭示肿瘤的细胞生态体系以及对靶向和免疫治疗产生的影响。

Illumina的技术:Nextera    XT    Sample    Preparation    Kit、NextSeq    500系统

  • Wei W, Shin YS, Xue M, et al. Single-Cell Phosphoproteomics Resolves Adaptive Signaling Dynamics and Informs Targeted Combination Therapy in Glioblastoma. Cancer Cell. 2016;29:563-573

成胶质细胞瘤是致死性最高的癌症之一。成胶质细胞瘤在多个可用作药物治疗的通路中存在突变,由于快速和广泛的耐药性,已证明当前的靶向治疗无效。具体来讲,雷帕霉素(mTOR)通路靶向机制是90%成胶质细胞瘤的关键驱动力,但是肿瘤细胞发展了对mTOR靶向治疗的快速耐药性。在本研究中,作者使用NextSeq    500系统获得单细胞基因组数据,并将这些数据与使用mTOR抑制剂治疗的肿瘤细胞中的单细胞蛋白组数据联系起来。这些数据显示成胶质细胞瘤肿瘤细胞中对mTOR抑制剂的耐药性在药物治疗开始几天内发生。令人惊讶的是,与单细胞测序数据的关联表明此耐药性通过非遗传机制(上调特定信号磷蛋白)进行。该研究启发了一种在治疗成胶质细胞瘤中设计药物复合治疗的新方法。
Illumina的技术:NextSeq    500系统

宏基因组学
虽然微生物是地球上最丰富和最多样的生命形式,但是在某些环境中仅培养出了其
中 0.1%–1%。 3单细胞基因组方法使我们重新理解了微生物生态学,极大地拓宽了
我们对生命树的视野。 这一理解还揭示了环境中病毒的范围和重要性及其在菌群形成中的作用。单细胞测序与基于功能或表型的筛选相结合,可以鉴定编码特定功能
或表型的微生物基因组。令人吃惊的是,细菌细胞克隆——微生物同质性的典范—— 还显示出复杂的集体动力学,可适应其局部环境。

对单个古菌和细菌细胞进行单细胞基因组测序, 
是解密未培养出的微生物遗传组成的重要途径。——Bowers 等,2017 年

  • Kashtan N, Roggensack SE, Berta-Thompson JW, Grinberg M, Stepanauskas R and Chisholm SW. Fundamental differences in diversity and genomic population structure between Atlantic and Pacific Prochlorococcus. ISME J. 2017;11:1997-2011

原绿球藻(Prochlorococcus)是一种可以进行光合作用的蓝绿藻,大量存在于海洋表面,对海洋生产力具有一定的贡献。此前的研究表明,大西洋中不同地点的原绿球藻群落表现出高度的基因组多样性,这表明海洋生境可影响基因组的结构和多样性。 在本研究中,作者从太平洋和大西洋的生境中采集了野生细胞群落样本。
他们使用Illumina    GAIIx系统对来自不同地点的原绿球藻进行了单细胞测序。他们发现,来自2个不同海洋地点的原绿球藻由各不重合且差异巨大的亚群落组成,具有不同的基因组骨架。这些数据表明,环境选择压力以及地理隔离可影响原绿球藻群落。
Illumina的技术:GAIIx 系统

  • Dyksma S, Bischof K, Fuchs BM, et al. Ubiquitous Gammaproteobacteria dominate dark carbon fixation in coastal sediments. ISME J. 2016;8:1939-1953

海洋沉积物是地球上最大的碳汇,其中一半的化学合成海洋碳固定发生在近海岸沉积物。但是,进行该活动的微生物却未知。通过测量横跨欧洲和澳大利亚13个近海岸沉积物的细菌16S核糖体RNA(rRNA)的基因多样性,作者鉴定出了属于硫氧化细菌的γ-变形菌纲组。14C-碳同化研究显示这些未培养出的γ-变形菌纲占近海岸沉积物中碳固定的80%。最后,作者从环境样本分离出来单个细胞,并执行了单细胞全基因组测序(WGS)以鉴定将氢氧化活动与硫氧化γ- 变形菌纲联系起来的基因。
Illumina的技术:MiSeq™和 HiSeq    2000系统

  • Eloe-Fadrosh EA, Paez-Espino D, Jarett J, et al. Global metagenomic survey reveals a new bacterial candidate phylum in geothermal springs. Nat Commun. 2016;7:10476

使用16S    rRNA测序的分子环境调查已在很大程度上扩展了我们对微生物种族发育多样性的知识。但是,一些细菌和古菌类群在当前调查中系统性代表性不足,或全部缺失。在本研究中,作者分析了5.2    Tb的元基因组学数据并发现了新的地热温泉中专有的细菌(Candidatus     Kryptonia) 。由于在常用的16S    rRNA引物中不匹配,该谱系在经典元基因组学调查中缺失。作者将元基因组学数据与单细胞测序结合起来,以生成代表了该门内四个独特属的高质量的基因组。
Illumina的技术:MiSeq 系统

  • Mende DR, Aylward FO, Eppley JM, Nielsen TN and DeLong EF. Improved Environmental Genomes via Integration of Metagenomic and Single-Cell Assemblies. Front Microbiol. 2016;7:143

单细胞基因组已为未培养微生物带来了大量单个基因组草图;但是,扩增步骤期间多链置换扩增技术(MDA)杂峰导致覆盖不完整以及不均匀。元基因组学数据集不会发生相同序列偏移,但微生物群落的基因组复杂性妨碍了基因组草图的再现。在本研究中,作者研发了一种新的从元基因组学引导的、单细胞扩增基因组装数据生成种群基因组装的新方法。该研究通过完成海洋组1奇古菌门和SAR324类群浮游细菌的单细胞扩增基因组验证了该方法。SAR324类群基因组改进的方法组合揭示了存在多个单细胞扩增基因组中未发现的基因。

Illumina的技术:TruSeq    LT    Nano    Kit、MiSeq系统

  • Spencer SJ, Tamminen MV, Preheim SP, et al. Massively parallel sequencing of single cells by epicPCR links functional genes with phylogenetic markers. ISME J. 2016;10:427-436

在微生物生态学研究中,16S    rRNA测序可鉴定微生物群落成员,而鸟枪法元宏基因组学可确定群落的功能性多样性。但是,将这两种方法组合起来在技术上具有挑战性。在本研究中,作者研发了乳液法、配对分离和链状结合PCR(epicPCR,一项将功能基因与种系发育标记联系起来的技术)。该研究将此技术应用于来自马塞诸塞Upper    Mystic    Lake的淡水中数百万的未培养单个细胞。具体来说,该研究分析了淡水湖群落内的硫酸盐还原群落,并可鉴定新的假定硫酸盐还原硫酸盐还原菌。该方法适用于鉴定功能群体成员,追踪基因导入并绘制微生物细胞内的生态学相互作用图。
Illumina的技术:MiSeq 系统

  • Lima-Mendez G, Faust K, Henry N, et al. Ocean plankton. Determinants of community structure in the global plankton interactome. Science. 2015;348:1262073

海洋浮游生物是世界范围内最大的生态体系,且由病毒、原核生物、真核微生物、浮游植物和浮游动物构成。该生态系统结构和组成受环境条件和养分供给的影响。在本研究中,作者分析了313个来自Tara    Oceans    expedition的浮游生物样本,并从Illumina测序的元基因组和18S    rDNAV9序列获得了病毒、真核生物和原核生物丰度谱。研究使用网络推理和机器学习法构建浮游生物群组之间的相互作用组。特别是作者通过将假定的宿主重叠群与从单细胞基因组获得的病毒数据比较,确认了预测的病毒 – 宿主之间的相互作用。
Illumina的技术:Illumina测序的元基因组(mi 标签)和 18S    rRNA    V9序列

干细胞
人类生命始于单个卵母细胞,卵母细胞进行有丝分裂生成构成人胚胎的细胞群。 胚胎干细胞(ESC)为来源于囊胚(早期植入前的胚胎)内细胞群的多能干细胞。每个干细胞都会进行一系列的细胞分裂,产生特定谱系,谱系决定了其遗传密码及其对局部环境因素的应答。这一过程产生了一系列独特的遗传异质性细胞。 在分化过程中对这些单个干细胞的测序帮助了对潜在机制的阐明。

单细胞测序为鉴定异质细胞群(包括干细胞)的组学级特征提供了有力工具。——Wen 和 Tang,2016年

造血干细胞(HSC)和调控其分化为红系细胞、髓系细胞或淋巴系细胞谱系的机制是细胞发育的独特示例。 单细胞测序已帮助鉴定出在脑损伤时反应性激活的神经干细胞群,揭示了治疗创伤性脑损伤的潜在方法。诱导多能干细胞(iPSC)为一类可直接从成熟细胞生成的多能干细胞,在细胞代替治疗中也具有潜在的使用价值。单细胞测序已帮助鉴定出单个iPSC的遗传异质性,以及调控其分化和多能性及其自组织为器官样结构的机制。

参考文献

  • Cabezas-Wallscheid N, Buettner F, Sommerkamp P, et al. Vitamin A-Retinoic Acid Signaling Regulates Hematopoietic Stem Cell Dormancy. Cell. 2017;169:807-823 e819

HSC是存在于骨髓中的多能干细胞,形成血液中的所有骨髓和淋巴细胞谱系。在小鼠中,少数HSC处于休眠状态,一生只分裂5次,维持着高长期重建潜能。休眠HSC可转变为激活HSC,后者仍保持静止状态,但已准备好进入细胞周期。调控这一转变的机制尚不明确。在本研究中,作者利用单细胞测序比较了单个休眠HSC、激活HSC和多能祖源细胞中的基因表达。他们利用荧光活化细胞分选(FACS)从HSC特异性绿色荧光蛋白(GFP)标志物过表达的转基因小鼠细胞中分离出了HSC。单细胞转录组数据表明,休眠HSC的特征是Myc 基因表达水平低,维甲酸基因表达水平高。此外,休眠HSC表达了低水平的基本生物合成通路所需的基因,而休眠HSC转化为激活HSC的特征是生物合成基因表达持续升高。总之,他们的数据为调控HSC激活的生物通路带来了新的见解,并表明了维甲酸 - 维生素 A 可调控小鼠 HSC 的可塑性。

Illumina的技术:Nextera    XT    Sample    Preparation    Kit、HiSeq    2000/2500系统

  • Velten L, Haas SF, Raffel S, et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 2017;19:271-281

传统RNA-Seq方法将单个细胞的基因表达数据一起进行了平均,破坏了细胞状态转化的关键信息。因此,传统RNA-Seq不适用于鉴定细胞状态或细胞在发育中的功能。单细胞RNA-Seq方法可测量大量单个细胞的基因表达,进而分类和确定细胞状态。目前的模型认为,在血细胞生成过程中,HSC逐步分化为不同的多能祖源细胞谱系。在本研究中,作者结合了单细胞RNA-Seq与功能分析以检验这一模型。他们使用HiSeq    2500系统对从人骨髓中分离的1,413个单个HSC进行了单细胞测序。另外,他们单独间接体内培养了2038个单个HSC以鉴定谱系潜能。然后整合了2个数据集,建立了转录组单细胞和功能单细胞数据的定量联系。他们的数据表明,单个 HSC 逐渐获得多个方向的谱系偏好,而没有转化为各层次的不同祖代细胞。
Illumina的技术:HiSeq    2500系统

  • Freeman BT, Jung JP and Ogle BM. Single-cell RNA-seq reveals activation of unique gene groups as a consequence of stem cell-parenchymal cell fusion. Sci Rep. 2016;6:23270

骨髓干细胞移植常用于治疗某些疾病(如白血病和淋巴瘤)。移植后,间充质干细胞可与脑、肝脏、小肠和心脏的实质细胞融合。该杂交导致的效应尚属未知。在本研究中,作者使用MiSeq系统执行单个间充质干细胞-心肌细胞杂种的scRNA-Seq,以鉴定全基因表达。细胞周期基因的表达在杂种细胞中普遍降低。但是,对于大多数其他基因组而言,各个杂种细胞在遗传上都各不相同。此外,两个杂种细胞在已遗传上与乳腺癌细胞相似,表明有必要监测干细胞移植是否出现肿瘤。
Illumina的技术:Nextera    XT    Sample    Preparation    Kit、MiSeq系统

  • Kang E, Wang X, Tippner-Hedges R, et al. Age-Related Accumulation of Somatic Mitochondrial DNA Mutations in Adult-Derived Human iPSCs. Cell Stem Cell. 2016;18:625-636

iPSC使得自体细胞替代治疗成为可能。维持培养诱导性多功能干细胞的基因完整性是潜在治疗的重要考虑。作者鉴定了来自年轻或老年受试者细胞中体细胞线粒体DNA(mtDNA)突变的频率。数据显示诱导性多功能干细胞中的mtDNA突变频率随个体年龄增长而升高。结果强调基因监测诱导性多功能干细胞中mtDNA突变的重要性,尤其是来自老龄患者的突变。
Illumina的技术:Nextera    XT    Sample    Preparation    Kit、MiSeq系统

  • Luo Y, Coskun V, Liang A, et al. Single-cell transcriptome analyses reveal signals to activate dormant neural stem cells. Cell. 2015;161:1175-1186

组织特定干细胞的不足,以及其周围环境的复杂性使得单细胞测序对于鉴定这些细胞类型必不可少。在本研究中,作者使用单细胞测序和加权基因表达网络分析鉴定来自成年小鼠前脑神经区的CD133+室管膜细胞为NSC。将这些细胞亚群富集用于免疫应答基因以及基因编码血管生成因子富集。血管内皮细胞生长因子 (VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理增强了迁移,并诱导分化为神经元和神经胶质细胞。
Illumina的技术:HiSeq    2500系统

  • Paul F, Arkin Y, Giladi A, et al. Transcriptional Heterogeneity and Lineage Commitment in Myeloid Progenitors. Cell. 2015;163:1663-1677

血细胞生成是一个发育过程,通过该过程骨髓来源的HSC分化为红系细胞、髓系细胞或淋巴系细胞谱系。在本研究中,作者将大量平行scRNA-Seq与荧光激发细胞分选术(FACS) 、染色质分析、遗传干扰和计算模型结合起来,以鉴定骨髓祖细胞群的转录组。单细胞转录数据将HSC分为具有7个分化状态的多个祖细胞亚群组。这些数据为在单细胞水平研究血细胞生成提供了新的参考模型。
Illumina的技术:NextSeq    500和 HiSeq    1500系统

发育生物学

一般来说,对于研究者而言,仅少量细胞可用于研究发育生物学。细胞环境中的微 小变化以及时序变化对细胞行为有深远影响。 单细胞方法已使我们对肿瘤、 神    经, 和免疫系统, 发育有了新的理解。这一理解反过来促使了对血细胞生成所涉 及的细胞谱系和调控网络的突破性了解。

在发育期间检测多个细胞的基因组揭示了发育谱系树,而细胞转录组则为我们提供了关于细胞的调控状态及其潜能上的逐步限制的信息。 ——Marioni和 Arendt,2017 年

人类胚胎植入前发育研究通常基于少量样本(常常混合)。  这些研究无法捕获人类 胚胎植入前发育前几天的详细情况。近期的单细胞测序研究开始捕获更多的全面详细 的情况。

单细胞方法还提供了了解其他模式生物(如小鼠 和斑马鱼 以及秀丽隐杆线虫 ) 胚胎发育的机会,并且有助于更好地理解人类胚胎发育所涉及的调控机制。 , 比较 单细胞研究甚至开始揭示胚层的进化史——过去  年发育生物学中的基本概念。

参考文献

  • Bae T, Tomasini L, Mariani J, et al. Different mutational rates and mechanisms in human cells at  pregastrulation and neurogenesis. Science. 2018;359:550-555

体细胞突变是基因组DNA序列的永久性改变,由细胞中DNA复制错误或环境因素导致。此前利用单细胞测序 法进行的研究证明,单个神经元含有独特的单核苷酸变异(SNV)体细胞突变,这一现象称为基因组嵌合。  尽管基因组嵌合常见于多种细胞类型中,但是神经元是有丝分裂后细胞,因此SNV可持续存在并改变神经 元功能。在本研究中,作者从胚胎样本的前脑中分离了单个神经元,在培养基中培养为小克隆。他们利用 HiSeq平台分析了这些样本的基因组,从每个细胞中鉴定出了200–400个SNV。这些胚胎神经元中的SNV模 式与癌细胞基因组中的类似。通过分析不同胚胎发育阶段的神经元的基因组,研究确定,在神经发生过程中 突变率加快。这些数据表明,相较于神经发育晚期的神经元,胚胎神经元受到保护不会发生突变。

Illumina的技术:HiSeq   2500和 HiSeq    X系统

  • Cao J, Packer JS, Ramani V, et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular  organism. Science. 2017;357:661-667

单细胞测序法在分析生物组织的遗传和细胞多样性中有着重要作用。在本研究中,作者在一项全面的生物 体的单细胞测序研究中扩展了这一观念。他们利用NextSeq     500系统对秀丽隐杆线虫L2幼虫阶段的全部 50,000个细胞进行了单细胞RNA-Seq。为实现这一目标,他们开发了组合索引方法以独特标记大量单个细胞 的转录组,此方法称为sci-RNA-seq。他们的单细胞转录组数据表明,秀丽隐杆线虫L2幼虫由27种不同细 胞类型组成,其中包括一些在生物体中极为罕见的类型。此外,他们整合了sci-RNA-seq数据与染色质免疫 沉淀测序(ChIP-Seq)数据,确定了转录因子对特定细胞类型的影响。他们的工作证明了单细胞测序法在重 构整个生物体的细胞组成上的能力,并为线虫类生物学家提供了有价值的资源。

Illumina的技术:Nextera        XT      Sample  Preparation     Kit、NextSeq    500系统

  • Halpern KB, Shenhav R, Matcovitch-Natan O, et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global  division of labour in the mammalian liver. Nature. 2017;542:352-356

肝是代谢物解毒、产生载体蛋白和消化必需的生化物质的重要器官。从解剖学上讲,肝由肝小叶组成,肝小 叶为六边形,对于将血液从肝中运输出去极为重要。肝小叶由 15 个肝细胞放射状层构成,肝细胞是肝内的主 要细胞类型,各放射状层在不同的过程中特化。 由于各肝小叶内高度特化的微环境,批量测序方法的分辨 率不足以鉴定每个放射状层内的区域基因表达。在本研究中,作者结合了分离的单个肝细胞的单细胞RNA测 序和肝组织切片的单分子荧光原位杂交(smFISH) 。单细胞RNA-Seq能够测量数千个细胞的基因表达模式, 而smFISH能够测量许多重要基因的原位表达水平。综合数据表明,肝小叶内表达的所有基因均为区域表达, 50% 的肝基因进行了区域表达。此方法适于重构其他器官的空间基因表达。

Illumina的技术:HiSeq        2500系统

  • Bolton H, Graham SJ, Van der Aa N, et al. Mouse model of chromosome mosaicism reveals lineage- specific depletion of aneuploid cells and normal developmental potential. Nat Commun. 2016;7:11165

人类胚胎植入前胚胎常显示出染色体嵌合现象,通常为整倍体-非整倍体嵌合,附带有正常和异常细胞。该 嵌合现象在发育早期,受精后最开始的少数细胞分裂期间出现。虽然胚胎植入前嵌合现象常见,并导致较高 的人早期妊娠失败率,胚胎中的非整倍体细胞的命运仍不清楚。在本研究中,作者通过在四到八细胞期对发 育中的小鼠胚胎给予逆转素处理研发了一种胚胎植入前染色体嵌合现象的小鼠模型。发育的小鼠胚胎随后通 过使用活细胞成像和单细胞测序的组合进行鉴定。数据显示非整倍体细胞通过细胞凋亡从胚胎中清除,从即 将植入前开始。嵌合体整倍体-非整倍体胚胎与正常胚胎相比,只要含有充足的整倍体细胞比例,就有类似 的发育潜力。

Illumina的技术:Nextera      XT      Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2000/2500系统

  • Adrian J, Chang J, Ballenger CE, et al. Transcriptome dynamics of the stomatal lineage: birth,  amplification, and termination of a self-renewing population. Dev Cell. 2015;33:107-118

植物气孔便于植物与大气进行气体交换。在拟南芥中,气孔的产生和方式来自可解析成中间步骤的分散谱系。 尽管核糖核酸酶L(RNase      L)具有生物学显著性,但此酶切割的RNA尚未清楚地确定。在本研究中,作者 使用 Illumina 测序揭示宿主和病毒 RNA 中 RNase      L 分裂位点的频率和位置。方法使用经 RNase        L 和 RNase       A分裂的病毒RNA,以及来自感染和未感染HeLa细胞系的RNA进行优化并验证。作者确定了受RNase    L 和 其他单链特定核糖核酸内切酶作用的散在基因组区域。监测宿主和病毒RNA中RNase内分裂位点的频率和 位置揭示了这些酶如何对健康和疾病产生影响。

Illumina的技术:TruSeq       SBS     Kit       v3–HS、HiSeq    2000系统

  • Burns JC, Kelly MC, Hoa M, Morell RJ and Kelley MW. Single-cell RNA-Seq resolves cellular complexity  in sensory organs from the neonatal inner ear. Nat Commun. 2015;6:8557
    内耳的耳蜗和前庭感觉上皮细胞使用相似的细胞类型传导两种类型的刺激:声音和加速。但是,每个单独的 感觉上皮细胞由解剖学和生理学异质性细胞类型组成,由于每种细胞类型的数量有限,使得对转录特性毫无 头绪。在本研究中,作者对来自新生小鼠椭圆囊和耳蜗感觉上皮细胞的301个单独细胞执行了RNA-Seq。聚 类分析确定了每种细胞类型的不同转录谱。对椭圆囊和耳蜗内细胞类型表达数据的比较表明听觉和前庭细胞 之间有差异。

    Illumina的技术:Nextera       XT      DNA     Sample  Preparation     Kit、Nextera    XT      DNA     Sample    Preparation      Index  Kit、HiSeq      1000系统

    • Hashimshony T, Feder M, Levin M, Hall BK and Yanai I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the  evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 2015;519:219-222

在动物中,胚层产生所有组织和器官,是发育生物学的组织原则。中胚层存在于复杂的两侧对称性动物中, 但在腔肠动物和栉水母类(梳子胶)中不存在,表明中胚层是进化的最终胚层。作者使用HiSeq        2000系统 分析一起构成整个胚胎的单个线虫分裂球(AB、MS、E、C和P3)的转录组。研究还使用通过线性扩增测序             (CEL-Seq)的细胞表达生成了整个胚胎的时序进程,横跨整个单细胞阶段至独立生存幼虫的过程,分辨率为 10分钟。研究发现线虫中胚层的基因表达程序在外胚层和内胚层的基因表达程序之后诱导发生。此外,内胚 层表达程序激活早于内胚层程序。该结果还观察了青蛙(非洲爪蟾热带属)、海葵(海葵目)和海绵(多空 动物门)的内胚层同源序列表达。总之,这些观察表明内胚层程序可追溯至多细胞起源,而外胚层则源自第 二胚层。

Illumina的技术:HiSeq       2000系统

  • Lodato MA, Woodworth MB, Lee S, et al. Somatic mutation in single human neurons tracks  developmental and transcriptional history. Science. 2015;350:94-98

神经元是有丝分裂后细胞,因此其基因组尤其易受DNA损伤。在本研究中,作者通过执行36个单个皮层神 经元的单细胞WGS,对人类大脑中的体细胞单核苷酸位点变异(SNV)情况进行了测量。最丰富的SNV包括 非编码、非编码RNA、内含子和基因间SNV。编码、截取、拼接和沉默SNV的丰度要少很多。此外,数据显 示每个皮层神经元都有独特的基因组,包含最多1580个体细胞SNV。最后,体细胞SNV创建了嵌套连接树, 表明体细胞突变可用于重建神经元的发育谱。

Illumina的技术:TruSeq      Nano    LT      Sample  Preparation     Kit、MiSeq、HiSeq       2000 和 HiSeq   XTen 系统

  • Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF and Regev A. Spatial reconstruction of single-cell gene  expression data. Nat Biotechnol. 2015;33:495-502

scRNA-Seq是一种发现新细胞类型、了解调控网络和重建发育过程的成熟方法。但是,scRNA-Seq通常涉 及来自组织的分离细胞,因此破坏了其自然空间关系。为在scRNA-Seq数据中捕获空间关系,作者研发了 Seurat,一种将较小的引导空间指定的“标志”基因集的scRNA-Seq与补充性原位杂交数据结合起来的计算 策略。研究通过空间绘制从斑马鱼胚胎分离的851个单个细胞并创建空间模式的全转录组图对Seurat进行了 验证。Seurat 可正确定位细胞的罕见亚群,并可绘制空间受限细胞以及表达模式更分散的细胞。

Illumina的技术:Nextera XT      DNA     Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2500系统

  • Tohonen V, Katayama S, Vesterlund L, et al. Novel PRD-like homeodomain transcription factors and  retrotransposon elements in early human development. Nat Commun. 2015;6:8207

人类胚胎植入前发育需要在受精后的前三天进行胚胎基因组激活以及母体转录降解。考虑到样本稀少以及缺 乏合适的方法,该阶段过程的研究在技术上富有挑战性。为克服这些阻碍,作者对来自两到三天人类胚胎的 348个卵母细胞、受精卵和单个分裂球执行了scRNA-Seq。研究显示32和129基因分别在从卵母细胞转变 为四细胞期以及从四细胞期转变为八细胞期的过程中转录。几个转录的基因未被标注为PRD样同源框基因, 包括 ARGFX、CPHX1、CPHX2、DPRX、DUXA、DUXB、和LEUTX。

Illumina的技术:GAIIx、HiSeq      1000、HiSeq     2000和 MiSeq系统

  • Zhan J, Thakare D, Ma C, et al. RNA sequencing of laser-capture microdissected compartments of the  maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. Plant Cell.  2015;27:513-531

谷类内胚乳是全球范围内食品、饲料和原料的主要来源,但是内胚乳细胞分化的基因控制尚不清楚。在本研 究中,作者将激光捕获显微解剖(LCM)和Illumina测序结合起来,以分析玉米(玉蜀黍)仁的分化中内胚 乳的五种主要细胞类型和四个代谢区的mRNA。研究确定了在各个代谢区专门累积的mRNA以及在一个或多 个代谢区优势表达的基因。研究结果表明MRP-1转录因子可激活基底内胚乳转移层内的基因调控网络。这些 数据提供玉米仁代谢区的高分辨率基因活动图集。研究还揭示了与主要内胚乳细胞类型分化相关的调控分子。

Illumina的技术:TruSeq   DNA     Sample  Preparation       v2      Kit、HiSeq      2000系统

免疫学

免疫系统由大量在宿主免疫系统发挥独特作用的特定细胞类型组成。在适应性免疫系 统中,T和B淋巴细胞(T和B细胞)表达特定表面受体(T细胞受体[TCR]和B细 胞受体[BCR]),通过主要组织相容性复合体(MHC)识别并结合在抗原呈递细胞表 面存在的特定抗原。通常,基于特定的表面分子标记,通过FACS分离各个免疫细胞 类型。 但是由于FACS的技术限制,FACS分离的细胞可能仍由处在不同发育或激活 阶段的混合群体组成,且FACS方法受可用的标记所限。  与之相反,单细胞测序法 不受特定分子标记的限制,并且可识别T细胞和B细胞中特定基因表达模式和剪接   变异。

计算机科学和单细胞测序技术的进步为免疫学带来了数据驱动型革新。”——Neu 等,2017年

单细胞测序法正在重塑我们对过敏原特异性B细胞在食物过敏以及B细胞介导的 中和抗体对感染物的反应中所发挥的作用的理解。  单细胞测序法还阐明了调控人类 自体免疫性疾病中的T细胞分化和生物学过程的新机制,包括类风湿性关节炎、 系 统性红斑狼疮(SLE) 、多发性硬化症I 型糖尿病和自身免疫性脑脊髓炎。 阻断CTLA-4和PD-1的抗体在大量癌症中诱发临床反应,包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、 膀胱癌和霍奇金淋巴瘤

B 细胞抗体库

使  抗体由B细胞在贯穿机体整个生命过程的一系列以发育顺序进行的体细胞基因重排 中产生。抗体由二硫键连接的重链(VH)和轻链(VL)构成,决定了抗原结合的特异 性。每个B细胞包含独特的由多个不同基因位点编码的VH 和VL 对。要正确预测抗体– 抗原结合的特异性,应从同一单个 B 细胞分析 VH 和VL 基因。

T 细胞抗体库
每个T细胞表达独特的TCR,TCR为由α和β链的独特组合构成的异二聚体蛋白质。 TCR与抗原呈递细胞表面的MHC呈递的多肽抗原结合。多种单细胞测序法可用 于 TCR 测序,而无需通过细胞裂解破坏α和β链配对。

参考文献

  • Chung W, Eum HH, Lee HO, Lee KM, Lee HB, et al. Single-cell RNA-seq enables comprehensive  tumour and immune cell profiling in primary breast cancer. Nat Commun. 2017;8:15081

单细胞方法表明,肿瘤具有遗传异质性。在本研究中,作者使用 HiSeq 2500 系统对从乳腺癌肿瘤中分离出的 515个单个细胞进行了RNA-Seq。单细胞转录组分析确立了亚型特异性乳腺癌细胞的异质性及其保守的基因 表达特征。此外,作者还鉴定了T细胞、B细胞和巨噬细胞的基因表达特征。单个T细胞包括激活T细胞和 耗竭T细胞两类,这表明免疫细胞与肿瘤间的相互作用动态且各异。这些数据表明,各个乳腺癌肿瘤微环境 种包含的细胞都具有独特的基因表达模式。此外,肿瘤亚型由肿瘤微环境中的肿瘤细胞以及免疫细胞共同决定。
Illumina的技术:Nextera        XT      DNA     Sample  PrepKit、TruSeq      Rapid   SBS     Kit、HiSeq      2500 系统

  • Martinez-Jimenez CP, Eling N, Chen HC, et al. Aging increases cell-to-cell transcriptional variability  upon immune stimulation. Science. 2017;355:1433-1436

随着细胞衰老,其生理和功能逐渐衰退。但是,这种时间依赖性衰退的分子机制目前尚不明确。在本研究中, 作者利用单细胞RNA-Seq揭示了衰老对免疫系统的影响。他们使用HiSeq    2500系统对年幼和年老小鼠中经 刺激和未经刺激的初始和记忆CD4 +    T 细胞进行了RNA测序。他们发现,较老的T细胞比年轻T细胞的基因 表达变异性高很多。变异性增高也与年老小鼠的免疫应答协调缺失有关。这些数据表明,单个细胞中与年龄 相关的转录变异性可能是衰老细胞的生物标志物。

Illumina的技术:Nextera  XT      DNA     Sample  Kit、HiSeq      2500系统

  • Villani AC, Satija R, Reynolds G, et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic  cells, monocytes, and progenitors. Science. 2017;356:eaah4573

所有的血液细胞成分都源自HSC,这一生物过程称为血细胞生成。在形成的多种细胞类型中,单核细胞和树 突状细胞是免疫系统的关键组分。树突状细胞加工抗原并呈递给T细胞,从而激活适应性免疫应答。两种细 胞类型都由多种亚型构成,不同的亚型通过结合细胞形态、定位和表面标记的表达进行区分。在本研究中, 作者对从人类血液中分离并使用FACS对树突状细胞和单核细胞进行富集后的2400个单个细胞进行了单细胞 测序。这一无偏策略重新鉴别出了6个树突状细胞和4个单核细胞亚型。这些数据提供了对树突状细胞和单 核细胞的更精细的理解,也提出了确定免疫系统整体分类的新方法。

Illumina的技术:Nextera        XT      DNA     Sample  Kit、HiSeq      2500系统

  • Zheng C, Zheng L, Yoo JK, Guo H, Zhang Y, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer  Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 2017;169:1342-1356 e1316

    HCC是全世界癌症死亡的主要原因,在亚洲和非洲的发病率最高。虽然癌症免疫疗法为其他肿瘤类型带来了 希望,但其在HCC治疗上仍未取得成功,尽管HCC肿瘤含有高水平的肿瘤浸润性单核细胞。在本研究中, 作者利用单细胞RNA-Seq,视图了解和鉴定HCC中的肿瘤浸润性单核细胞。具体来说,他们从6个HCC样 本的外周血、肿瘤和邻近的正常组织分离了5000多个T细胞。然后使用HiSeq  2500/4000系统对单个T细 胞进行了深度RNA-Seq和TCR测序。结合单细胞转录组谱和TCR序列,鉴定了11个不同的T细胞亚型。 值得注意的是,作者发现,耗竭的CD8+     T 细胞和Tregs 细胞在HCC中富集并克隆扩增。此研究证明了单细胞 测序法在鉴定 HCC 肿瘤微环境和肿瘤浸润性细胞的特征中的用途。

    Illumina的技术:HiSeq  2500/4000系统

  • Kimmerling RJ, Lee Szeto G, Li JW, Genshaft AS, Kazer SW, et al. A microfluidic platform enabling  single-cell RNA-seq of multigenerational lineages. Nat Commun. 2016;7:10220

单细胞测序已增强了鉴定癌症、免疫系统和多能干细胞中的转录异质性的分辨率。scRNA-Seq测量通常依赖 于单个时间点测量。可提供组织异质性的快照,但同时将这些测量扩展到一系列时间点,这样可大大增强我 们对产生组织异质性的机制的理解。在本研究中,作者研发了一个微流控平台,可在多代谱系追踪之后进行 芯片外scRNA-Seq。他们使用该平台采集小鼠淋巴细胞白血病细胞谱系以及原代鼠CD8+      T 细胞的单细胞转 录数据。结果揭示了每种细胞类型的转录标记取决于谱系和细胞周期。

Illumina的技术:NextSeq        500系统

  • Stubbington MJ, Lonnberg T, Proserpio V, et al. T cell fate and clonality inference from single-cell  transcriptomes. Nat Methods. 2016;13:329-332

TCR可高度特异性识别抗原。这部分是由于在T细胞发育过程中由V(D)J位点重组产生的TCR高度遗传 异质性。在本研究中,作者研发了TraCeR,一种可从scRNA-Seq数据重建全长配对TCR序列的算法。在 scRNA-Seq数据中审视重组TCR序列的能力使得作者可通过揭示细胞和其转录谱之间的克隆关系,将T细胞 特异性与功能性反应联系起来。

Illumina的技术:Nextera     XT      DNA     Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2500系统

  • Tirosh I, Izar B, Prakadan SM, Wadsworth MH, 2nd, Treacy D, et al. Dissecting the multicellular  ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science. 2016;352:189-196

    单细胞测序可详细评估肿瘤内各个细胞中存在的基因和转录特性。该技术可通过评估肿瘤内的恶性程度、微 环境和免疫状态提供治疗反应和耐药性信息。在本研究中,作者对从 19 位患有转移性黑色素瘤患者分离出的 4645个单细胞(恶性的、间质的、免疫的、内皮的)进行scRNA-Seq。该研究发现同一肿瘤内的恶性细胞显 示出与细胞周期、空间关系和耐药性相关的转录异质性。同一肿瘤包含具有MITF高表达水平的细胞,以及 具有低MITF水平和AXL激酶水平升高的细胞(易于发生早期耐药性的细胞)。浸润的T细胞分析揭示了排 除程序、与T细胞活化/扩张的联系和患者变异性。本研究阐明了单细胞基因组如何能揭示肿瘤的细胞生态 体系以及对靶向和免疫治疗产生的影响。

    Illumina的技术:Nextera        XT      Sample  Preparation     Kit、NextSeq    500系统

  • Avraham R, Haseley N, Brown D, et al. Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host  Immune Responses. Cell. 2015;162:1309-1321

    免疫细胞和入侵病原体之间的相互作用决定感染过程。大量细胞测序法可掩藏细胞–病原体相互作用的异质 性、随机性和动态性。在本研究中,作者使用HiSeq     2500系统通过荧光标记执行scRNA-Seq,以探测150个       单个巨噬细胞对沙门氏菌侵袭菌株的反应。研究数据显示,不同的PhoPQ活度,其可上调感染沙门氏菌中 沙门氏菌毒力因子,通过修饰细菌亚组中的脂多糖(LPS)驱动了多种宿主细胞I型干扰素(IFN)应答。结 果表明宿主细胞对感染应答的功能性异质性与感染病原体群体的细胞间变异有关。

    Illumina的技术:HiSeq       2500系统

  • Fan HC, Fu GK and Fodor SP. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene  expression cytometry. Science. 2015;347:1258367

单细胞组合标记快速且相对便宜,并且可在很大程度上提高大规模平行单细胞测序法的通量。在本研究中, 作者研发了CytoSeq,一种组合标记大量单个细胞的方法。单个细胞与包含细胞和转录本条形码探针的微珠 组合文库一起放在单独的小孔中。作者对人外周血单核细胞执行(PBMC)CytoSeq,并使用 MiSeq 系统对 扩增的cDNA测序。研究分析了多个基因,并可确定PBMC的主要亚组。此外,通过比较初始和巨细胞病毒             (CMV)激活的 CD8+     T 细胞的细胞异质性,研究确定了特定于 CMV 抗原的罕见细胞。CytoSeq可用于不同大 小和形状细胞的复杂混合体,以及其他生物分子。

Illumina的技术:MiSeq 系统

  • Gaublomme JT, Yosef N, Lee Y, et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell  Pathogenicity. Cell. 2015;163:1400-1412

小鼠的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)作为人类CNS脱髓鞘疾病(包括多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎) 的动物模型被广泛研究。生成IL-17的Th17细胞是适应性免疫系统的及其重要部分,但也与自体免疫的发 病机理有关。在本研究中,作者使用HiSeq    2000/2500系统对976个从患有EAE小鼠的CNS和淋巴结分离 出的单个Th17细胞执行RNA-Seq。scRNA-Seq数据的计算分析揭示了Th17细胞的显著遗传异质性,并将 其与覆盖调控到病原功能状态的Th17细胞谱联系起来。作者鉴定并验证了 96 四个调控Th17致病性的基因           (Grp65、Plzp、Toso、和Cd5l),揭示了自体免疫中的新药物靶点。

Illumina的技术:Nextera     XT      DNA     Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2000/2500系统

  • Tipton CM, Fucile CF, Darce J, et al. Diversity, cellular origin and autoreactivity of antibody-secreting  cell population expansions in acute systemic lupus erythematosus. Nat Immunol. 2015;16:755-765

急性SLE为复发性自体免疫性疾病,攻击多种组织且无法治愈。自身免疫活动与B细胞骤增相关。美国食品 药物管理局(FDA)批准的唯一SLE疗法——贝利单抗,靶标B细胞激活因子。在本研究中,作者从正在遭 受SLE爆发的患者分离了B细胞,并使用深度测序和蛋白组学法分析B细胞的多样性。研究表明来自SEL 爆发患者的B细胞为多克隆。通过测序单个B细胞,研究还鉴定了新激活的在SLE爆发期间提供自身抗体重 要来源的B细胞亚群,表明SLE自体反应发生于多克隆激活期间。这些结果可指导患者治疗选择,并方便未 来 SLE 治疗的计划。

Illumina的技术:MiSeq 系统

神经生物学

在构成特定脑区域的细胞中,单细胞测序法在单个神经元中发现了基因组嵌合,包括 CNV和体细胞SNV。脑中基因组嵌合涉及的遗传变异出现于胎儿发育期间,尽管 其功能关联尚不完全明确,但近期的数据表明衰老和神经退行与神经元中的体细胞突 变有关。 近期的单细胞测序研究还在海马体和大脑皮层中鉴定出了高频率的体细胞 LINE-1 元件(L1)反转座,这可能对正常脑功能有重要意义; 但是,其他研究已确 定大脑中的 L1 反转座率低于首次报道

单细胞RNA测序是一项令人兴奋的新技术,能够 分析单个细胞的转录组,非常适用于应对中枢神经 系统固有的复杂性和动态特征。”——Ofengeim等,2017 年

除了CNS基因组多样性之外,近期的研究还扩展了我们对成人大脑以及三维脑类器 官单细胞水平CNS转录组多样性的理解。单细胞转录组已确定了调控神经 发育的机制,最近  scRNA-Seq研究开始揭示感觉神经元、  胶质细胞、 中间神 经元、 和大脑中其他细胞类型的新生物学信息。  单细胞测序的新技术成就结合 了scRNA-Seq与单个神经元的电生理记录,  以及对与单个海马神经元中经验驱 动的诱导活动相关的基因表达模式的鉴定。 最后,近期对来自单个神经元细胞核的 6000个甲基化组进行了单细胞分析,确定了人前皮层中的神经元亚型。

参考文献

  • Bae T, Tomasini L, Mariani J, Zhou B, Roychowdhury T, et al. Different mutational rates and  mechanisms in human cells at pregastrulation and neurogenesis. Science. 2018;359:550-555

    体细胞突变是基因组DNA序列的永久性改变,由细胞中DNA复制错误或环境因素导致。此前利用单细胞测 序法进行的研究证明,单个神经元含有独特的SNV体细胞变异,这一现象称为基因组嵌合。尽管基因组嵌 合常见于多种细胞类型中,但是神经元是有丝分裂后细胞,因此SNV可持续存在并改变神经元功能。在本研 究中,作者从胚胎样本的前脑中分离了单个神经元,在培养基中培养为小克隆。他们利用HiSeq平台分析了 这些样本的基因组,从每个细胞中鉴定出了200–400个SNV。这些胚胎神经元中的SNV模式与癌细胞基因 组中的类似。通过分析不同胚胎发育阶段的神经元的基因组,研究确定,在神经发生过程中突变率加快。这 些数据表明,相较于神经发育晚期的神经元,胚胎神经元受到保护不会发生突变。

Illumina的技术:HiSeq  2500和 HiSeq    X系统

  • Luo C, Keown CL, Kurihara L, et al. Single-cell methylomes identify neuronal subtypes and regulatory  elements in mammalian cortex. Science. 2017;357:600-604

单细胞 RNA-Seq 方法适用于确定脑中的多种神经元亚型。  在本研究中,作者开发了一种鉴定单个神经元 细胞中的表观基因组多样性的技术。这一技术即单核苷酸甲基胞嘧啶测序(snmC-seq) ,该技术利用了神经 元中大量存在的 5-甲基胞嘧啶。作者从小鼠大脑皮层中分离了        3400    个单个神经元并通过      FACS    收集了细胞 核。然后用亚硫酸氢盐处理了核DNA,将未甲基化的胞嘧啶转化为脲嘧啶,5-甲基和    5-羟甲基胞嘧啶不受影 响。最后,混合、扩增样本并使用      HiSeq   4000    系统进行测序。作者利用  snmC-seq        生成了分离的神经元细 胞核的6000 个甲基化组,数据确定小鼠脑中有  16      个小鼠神经元亚型。他们还对从人大脑皮层样本中分离的 核进行了     snmC-seq,鉴定出了21      个人类神经元亚型。因此,单细胞甲基化组技术扩展了脑细胞多样性的分 类。此外,它确定了与神经元多样性相关的调控元件。

Illumina的技术:TruSeq        Methylation     Kit、HiSeq      4000系统

  • Lodato MA, Rodin RE, Bohrson CL, et al. Aging and neurodegeneration are associated with increased  mutations in single human neurons. Science. 2018;359:555-559

衰老与复制错误累积导致的细胞内体细胞突变增加有关。关于这是否适用于不分裂的有丝分裂后神经元尚不 明确。在本研究中,作者从4个月到82岁的个体中分离了161个单个有丝分裂后神经元。他们对每个单个 神经元进行了单细胞WGS以鉴定SNV。数据表明,SNV随着年龄增长线性增加。他们还从8个患有早发性 神经退行性疾病的个体中分离了单个神经元。这些神经元的单细胞WGS表明其SNV比正常神经元中更为丰富。 总之,这些数据表明,神经元中与年龄相关的 SNV 积累可能对神经元疾病而言相当重要。

Illumina的技术:TruSeq     Nano    LT      Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2000和 HiSeq    X10 系统

  • Quadrato G, Nguyen T, Macosko EZ, et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive  human brain organoids. Nature. 2017;545:48-53

脑是极为复杂的器官,二维组织培养在理解脑功能方面能力有限。最近开发了三维组织培养脑类器官,寄望 于理解脑生物学、疾病和发育。 在本研究中,作者试图鉴定脑类器官模拟全脑复杂度和细胞多样性的程度。 他们对从31个人脑类器官种分离的80,000个单个细胞进行了单细胞RNA-Seq。单细胞基因表达特征表明, 人脑类器官发育产生了多种细胞类型,包括与成人皮层神经元和视网膜细胞相关的亚型。此外,类器官的细 胞内存在神经元连接和突触。最后,类器官自发发育出了神经元网络,光敏细胞甚至对光刺激敏感。总之, 数据表明人脑类器官具有作为人脑体外模型的巨大潜力。

Illumina的技术:Nextera      XT      DNA     Library Preparation       Kit、NextSeq    500系统

  • Cadwell CR, Palasantza A, Jiang X, et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling  of single neurons using Patch-seq. Nat Biotechnol. 2016;34:199-203

在本研究中,作者描述了Patch-Seq,一种将全细胞电生理学特性、形态学特性和scRNA-Seq结合起来的方法。 研究对来自小鼠新皮层层1的58个神经细胞执行了Patch-Seq。在研究确定单个神经元的电生理学特性后, 使用膜片钳移液管抽吸细胞内含物并将其制备用于RNA-Seq。作者基于电生理学和形态学,以及基因表达的 模式将细胞进行分类。研究数据显示基因表达谱可推论轴突分枝和动作电位幅度。

Illumina的技术:HiSeq   2000系统

  • Lacar B, Linker SB, Jaeger BN, et al. Corrigendum: Nuclear RNA-seq of single neurons reveals  molecular signatures of activation. Nat Commun. 2016;7:12020

scRNA-Seq一直是亚分类细胞的关键方法,否则可仅基于形态学和解剖学进行区分。分析对激活应答的单个神经元转录组对于确定脑功能非常重要。在本研究中,作者对取自海马体吗齿状回单个小鼠神经元的并列普 他唑刺激的分离细胞执行核RNA-Seq(snRNA-Seq) 。短暂曝光在新环境下之后,活化的神经元转录组中有 大规模变化,包括诱导分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路基因。数据显示已激活神经元的snRNA-Seq可进 行即将超出早期基因以外的基因表达分析。

Illumina的技术:HiSeq      2500系统

  • Tasic B, Menon V, Nguyen TN, et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell  transcriptomics. Nat Neurosci. 2016;19:335-346

考虑到人脑的复杂性,了解单个细胞的遗传和功能多样性至关重要。在本研究中,作者对超过1600个来自 小鼠初级视觉皮质的单个细胞执行了scRNA-Seq。研究数据分析确定了49种独特转录组细胞类型。这些转 录组细胞类型的亚组显示出特定的和不同的电生理学和轴突投射特性,可确认单细胞转录组特征可与特定细 胞表型联系起来。

Illumina的技术:Nextera     XT      DNA     Sample  Preparation     Kit、MiSeq和 HiSeq      2000/2500 系统

  • Evrony GD, Lee E, Mehta BK, et al. Cell lineage analysis in human brain using endogenous  retroelements. Neuron. 2015;85:49-59

有丝分裂后的体细胞突变会导致癌症,这些突变还可导致多种神经疾病,包括皮层畸形、癫痫、智力障碍和 神经退行性疾病。研究致病性体细胞突变具有挑战性,因为其作用由正常发育造成的方式有多种。在人大脑 中体细胞突变分布的整体模式没有清楚确定。在本研究中,作者使用 HiSeq     2000 系统对单个神经元执行高覆 盖度的WGS。来自多个CNS位置的单各神经元的体细胞突变分析确定了大脑中的多个细胞谱系,由不同的 L1反转座事件标记。体细胞突变的模式与已知的大脑发育体细胞突变障碍一样,表明在病灶分布的体细胞突 变也在正常大脑中存在。

Illumina的技术:HiSeq     2000系统

  • Hanchate NK, Kondoh K, Lu Z, et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations  during olfactory neurogenesis. Science. 2015;350:1251-1255

在哺乳动物中,嗅觉由鼻嗅上皮神经元中的G蛋白偶联的嗅觉感受器介导。成熟神经元通常在每个神经元 表达单个嗅觉感受器。在本研究中,作者使用HiSeq   2500系统对小鼠发育过程中的单个上皮神经元执行 scRNA-Seq,并对每个发育阶段的多个细胞进行测序。单细胞数据确认了大多数神经元仅高水平地表达一个 嗅觉感受器。但是,许多未成熟神经元低水平地表达多个嗅觉感受器,单个神经元可从最多七个不同染色体 表达嗅觉感受器。数据显示发育通路最终在成熟神经元中限制嗅觉感受器的表达。

Illumina的技术:TruSeq   DNA     Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2500系统

  • Llorens-Bobadilla E, Zhao S, Baser A, Saiz-Castro G, Zwadlo K and Martin-Villalba A. Single-Cell  Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain  Injury. Cell Stem Cell. 2015;17:329-340

在人脑内部,NSC池参与损伤后的大脑修复与再生。NSC的活化与静息平衡取决于特定转录因子的诱导。 在本研究中,作者使用HiSeq       2000系统执行从脑室下区分离出来的NSC的scRNA-Seq。该研究确定了休眠 NSC的特定亚群中谱系特定转录因子的表达。研究还发现脑缺血性损伤诱导了休眠NSC中的干扰素信号,促 进其进入原始的静息状态。本研究揭示了 NSC 活化涉及的一般分子原理,并指明了脑再生医学的潜在方法。

Illumina的技术:Nextera      XT      Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2000系统

  • Lodato MA, Woodworth MB, Lee S, Evrony GD, Mehta BK, et al. Somatic mutation in single human  neurons tracks developmental and transcriptional history. Science. 2015;350:94-98

    神经元是有丝分裂后细胞,因此其基因组尤其易受DNA损伤。在本研究中,作者通过执行36个单个皮层 神经元的单细胞WGS,对人类大脑中的体细胞SNV情况进行了测量。最丰富的SNV包括非编码、非编码 RNA、内含子和基因间SNV。编码、截取、拼接和沉默SNV的丰度要少很多。此外,数据显示每个皮层神经 元都有独特的基因组,包含最多1580个体细胞SNV。最后,体细胞SNV创建了嵌套连接树,表明体细胞突 变可用于重建神经元的发育谱。

    Illumina的技术:TruSeq       Nano      LT      Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2000和 HiSeq    X       Ten 系统

  • Luo Y, Coskun V, Liang A, Yu J, Cheng L, et al. Single-cell transcriptome analyses reveal signals to  activate dormant neural stem cells. Cell. 2015;161:1175-1186

由于组织特异性干细胞数量少,并且其周围环境复杂,因此必须使用单细胞测序法来鉴定这些细胞类型。在 本研究中,作者使用单细胞测序和加权基因表达网络分析鉴定来自成年小鼠前脑神经区的CD133+室管膜细 胞为 NSC。将这些细胞亚群富集用于免疫应答基因以及基因编码血管生成因子富集。VEGF 和 bFGF 处理增强 了迁移,并诱导分化为神经元和神经胶质细胞。

Illumina的技术:HiSeq  2500系统

  • Upton KR, Gerhardt DJ, Jesuadian JS, et al. Ubiquitous L1 mosaicism in hippocampal neurons. Cell.  2015;161:228-239

体细胞L1反转座发生于神经发生过程中,是神经元之间基因型变异的潜在来源。海马体中存在明显的L1活性, 但其生物学效应尚不清楚。在本研究中,作者使用MiSeq系统对单个海马神经元、海马神经胶质细胞和皮层 神经元执行单细胞反转座子捕获测序(RC-Seq)。这些实验已确定L1驱动的嵌合现象在海马体中大量存在, 与先前估计的每个皮层神经元<0.1个L1插入相比,每个海马神经元中具有13.7个体细胞L1插入。考虑到 L1 插入的丰富性,有理由假设 L1 驱动的嵌合现象可改变脑生物学和功能。

Illumina的技术:MiSeq 系统

  • Zeisel A, Munoz-Manchado AB, Codeluppi S, et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and  hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 2015;347:1138-1142

大脑由大量细胞类型构成,神经元为其中一个亚组。要了解大脑功能,确定该高度特异性细胞的复合集合 极其重要。在本研究中,作者基于3005个来自初级体感觉皮质和海马体CA1区域的单细胞转录组执行定量 scRNA-Seq。RNA 分子使用唯一的分子标识符(UMI)计算。双聚类算法揭示了细胞的9个主要类别,包括 锥体神经元、中间神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、血管内皮细胞、壁细胞和室管 膜细胞。研究人员确定了9种细胞类型中的47个分子不同子类。研究还确定了与细胞类型、形态学和位置一 致的唯一标记基因

Illumina的技术:HiSeq     2000系统



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