Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries

酵母滞留系统（YESS）对TEV蛋白酶突变体文库的工程化筛选

来源：PNAS

IF：9.58

摘要：蛋白酶的无数新应用将能够通过微调底物特异性和活性来开发。在此，我们提出了一个工程蛋白酶选择性和活性筛选的通用策略，即利用蛋白酶在酵母内质网(ER)内的滞留效用。由酵母粘附受体亚基Aga2、选择和反选择底物序列、多重插入表位标记序列和C端ER保留序列组成的底物融合蛋白与蛋白酶文库共表达。底物融合蛋白通过蛋白酶的裂解，消除了内质网的滞留序列，便于运输到酵母表面。与Aga蛋白融合表达的特异性底物其产物锚定在细胞表面，使用流式细胞仪将具有表位标记抗体的酵母细胞分离出来。利用该系统，烟草腐蚀病毒蛋白酶(TEV-P)被设计成特异性识别P₁处的Glu或His的突变体,野生型对其典型ENLYFQ底物P₁位点具有强烈的Gln偏好。动力学分析表明，TEV对Glu和His的选择性分别增加了5000倍和1100倍，两者都保持了较高的活性。人类颗粒酶K和丙型肝炎病毒蛋白酶也被证明使用这种独特的方法。此外，这个系统也被证明与人源酪氨酸激酶兼容，通过调整信号策略来识别磷酸化而不是水解序列。