目前RNA-Seq是挖掘不同生长时期及不同胁迫条件下、不同组织细胞中其差异表达基因通常所采用的研究方法，同时还可以鉴定获得新的转录本信息以及不同的可变剪切事件，因而RNA-Seq目前应用很广泛。结合不同的RNA提取方法及文库构建流程对RNA-Seq获得的测序数据产生不同的影响。

      1.关于总RNA提取  

         关于RNA提取对于大家最为熟悉的是Trizol-based的RNA提取方法，也有结合试剂盒来进行提取的。在提取总RNA的过程中通常会引入影响后续PCR酶促反应的抑制剂等，这些抑制剂如不正确去除的话，会对后续的反转录、末端修复、加A以及接头连接和PCR扩增等产生影响，如阻碍聚合酶的聚合、影响聚合酶的活性甚至降解聚合酶等，从而对最终获得的测序数据造成影响。

         样本中常见的抑制剂包含由样本中本身就带有的和在实验操作过程中带入的，样本中本身包含的抑制剂如血液中的血红蛋白，植物样本中的腐殖酸、黄腐酸等；在实验过程中带入的抑制剂如EDTA、肝素、氯酚仿等。不同样本中可能引入的抑制剂或其他污染物会不一样，详见DNA/RNA Isolation Considerations When Using TruSeq Library Preparation。

        如果样本中存在这些抑制剂等污染物质的话，需结合试剂盒进一步进行纯化，比如过柱子过滤的试剂盒等，达到总RNA理想标准方可开展后续实验。

       总RNA提取结果检测标准：

       总RNA溶解环境：ph7.5-8.0；

       结合Qubit or Pico/RiboGreen/Agilent 2100进行检测；

Substance                                          Absorbance (nm)             260/280 Ratio Values     260/230 Ratio Values

Pure DNA                                             280 nm                                 ~1.8                                       2.0–2.2

Pure RNA                                             280 nm                                 ~2.0                                       2.0–2.2

EDTA, Carbohydrates, Phenol             230 nm                                 < 1.5                                      < 2.0

Guanidine HCL                                    230 nm                                 < 1.5                                      < 2.0

     2.关于去除rRNA

       考虑到总RNA中含有大量的rRNA序列，大约是在80%-90%的序列是rRNA，因而会结合不同的方法来去除总RNA中的rRNA。真核生物种常规的去除rRNA的方法是通过oligo(dT)富集带有polyA尾的mRNA来实现的，但是这种方法针对不含有polyA尾的转录本序列以及存在部分降解的总RNA样本，所以这种方法针对FF(Formalin-Fixed)样本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蜡包埋样本是不适用的，否则对获得样本中最全面的转录本信息会产生显著影响。

       针对于FF和FFPE样本以及原核生物的总RNA中去除rRNA，则需结合RiboZero、RiboMinus等是结合来开展去除，其实针对rRNA序列进行杂交捕获去除的原理来去除的。针对FFPE样本还有结合双链特异性核酸酶构建文库来降低后续测序数据中的rRNA序列比例的。

       常见去除rRNA方法：

        a. rRNA消减杂交法：相应的试剂盒有MICROBExpress bacterial mRNA enrichment kit (Ambion)，RiboMinus bacteria transcriptome isolation kit (Invitrogen) 和Ribo-Zero rRNA removal kit (Epicentre)；

         b. 5′单核苷酸依赖的外切酶处理法：相应的试剂盒主要有mRNA-ONLY prokaryotic mRNA isolation kit (Epicentre)；

         c. 选择性引物扩增法：相应试剂盒主要有Ovation prokaryotic RNA-seq system (NuGEN)；

         d. 依赖于双链特异核酸酶的cDNA均一化法：相应的试剂盒主要有trimmer-direct cDNA normalization kit(Evrogen)；

         e. 大肠杆菌 poly(A)聚合酶加尾法：相应的试剂盒有MessageAmp II-bacteria kit (Ambion)；与RNA结合蛋白Hfq 等免疫共沉淀法，由于Hfq 能够高效地结合small RNA，并能辅助它们与靶标mRNA结合，因此常用于small RNA及其靶标 mRNA 的研究。

      3. 关于文库构建

          针对去除rRNA之后获得的mRNA进行构建文库，通常有两种思路：

         a. 先对mRNA结合oligo(dT)进行反转录，再针对cDNA进行fragmentation；

         b. 先mRNA fragmentation再结合随机引物进行反转录。

          这两种方法获得的结果会有很多差异：a.蓝线；b.红线。

     上图显示先针对mRNA进行打断再进行反转录获得测序reads主要是针对基因本体的；若先反转录，尤其是结合oligo(dT)进行反转录获得的测reads对转录本3'端具有比较强的偏好性，所以在mRNA-Seq中建议采用先对mRNA打断再进行反转录的文库构建方法。

     根据mRNA文库构建类别，又分为常规的mRNA文库构建、均一化文库构建(引入双链特异性核酸酶)、全长cDNA文库以及链特异性文库构建(引入dUTP替换合成第二链中的dTTP)等，需根据具体的研究目的来选择，均一化文库构建可获得文库中低丰度表达基因信息、链特异性文库可获得正反向链上的转录本信息及可变剪切信息等。

     Macrogen 千年基因针对结合NGS平台测序RNA文库要求等详细信息汇总如下：      

*上述表格针对总RNA以及mRNA、病毒ssRNA的情况均有列出，供参考。

附参考文献（如有什么问题欢迎随时**我ttwu@macrogencn.com，谢谢！）：

1.Influence of RNA extraction methods and library selection schemes on RNA-seq data；

2.IVT-seq reveals extreme bias in RNA-sequencing；

3.Ribosomal RNA depletion for massively parallel bacterial RNA-sequencing applications；

4.Comprehensive comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low input samples；

5.illumina support；

6.Macrogen 千年基因support；

7.Prokaryotictranscriptomics: a new view on regulation, physiology and pathogenicity；

8. Efficientand robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex communitytranscriptomes；

9. Aperspective: metatranscriptomics as a tool for the discovery of novelbiocatalysts；

10.Deepsequencing analysis of small noncoding RNA and mRNA targets of the globalpost-transcriptional regulator；

11. Globalanalysis of small RNA and mRNA targets of Hfq；

12.Validationof two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics；

13.RNA-Seq a revolutionary tool for transcriptomics.pdf。