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使用UAS-GAL4系统在果蝇中敲低某一基因的表达

已有 493 次阅读 2019-5-14 21:36 |系统分类:科研笔记


在果蝇中,有一个比较著名的系统:UAS-Gal4系统。利用这个系统可以表达某一个基因。

uas-gal4系统示意图.png

这个系统需要两种品系的果蝇,一种是Gal4品系的果蝇,另外一种是UAS品系的果蝇。下面我们来分别看一下这两个品系的果蝇。

Gal4品系的果蝇:gal4是一个表达转录因子的基因,这个基因最开始是在酵母中发现的,然后科学家把它在果蝇中特定的组织中进行表达(没看文献,可能是把它克隆到某一个质粒载体上,然后这个质粒载体具有与想要进行特定表达的染色体可以重组的位点)。

总之,就是它可以被插到染色体上,在它的上游具有增强子或者启动子,可以调节它在特异性的时间或者空间上进行表达。

最近,师姐给我了一个actin-Gal4品系的driver line。

actin是肌动蛋白,actin 是看家基因在每个细胞中都进行均一表达。所以我觉的这个品系应该是把Gal4这个基因连到了actin的启动子的下游。

问题的关键来了,师姐告诉我这个品系是带有TMB6平衡子的,让我挑选直翅的果蝇和uas-RNAi品系的果蝇杂交。

我对平衡子一脸懵逼。就一步一步去查。

首先不同的果蝇具有不同的平衡子,有的果蝇具有平衡染色体,有的果蝇没有,常用的带有平衡染色体的果蝇有:

以下是从果蝇红宝书上找到的几种品系:

     image.png

下面就以我得到的TM6B的品系的果蝇,我想看幼虫时期的变化,所以主要以Tubby这个为主要的标记。

FireShot Capture 074 - (2 条消息) B1_Cyo_TM2_ TM6B是什么意思? - 知乎.png

FireShot Capture 074 - (2 条消息) B1_Cyo_TM2_ TM6B是什么意思? - 知乎.png

首先得到带有Tubby标记的Gal4品系的果蝇:

果蝇.bmp

现在得到的品系就是师姐给我的品系,我如果要与uas品系的果蝇进行杂交就应该筛选出Gal4的纯合品系。

具体的筛选过程如下:

微信图片_20190514203348.jpg

所以我需要挑选直翅的果蝇与下一代进行杂交,如果要从幼虫挑选的话,就挑选瘦的(没必要)。

以上,解决了Gal4品系的问题。

下面是UAS品系的问题。

我是从清华大学果蝇中心购买的UAS-PPO2-RNAi品系。

我需要做的是了解这个品系的果蝇是如何构建出来的,gal4转录因子与UAS结合之后不是启动靶基因的表达吗?怎么最后又变成了RNAi。

gal4转录因子和UAS结合之后启动的靶基因是shmiRNA。

首先用于构建UAS-RNAi品系的果蝇是含有attp位点的果蝇,我从清华大学果蝇中心的官网上下载的表格看到了我所敲的基因所用的载体是VALIUM 20,整合的位点是attp40.

http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=1076451&do=blog&id=1178913

FireShot Capture 075 - 清华大学果蝇中心 - fly.redbux.cn.png

所以我又去下载了VALIUM20的质粒图谱。

image.png

可以看到这个质粒上有attB位点,这个位点可以和果蝇染色体上的attP40发生整合,将这个shmiR插入到第二条染色体上。可以看到在这个质粒中含有UAS位点。然后通过杂交,筛选出纯合品系,我得到的应该就是纯合品系。

好了,现在两个品系的问题都解决了,这下将两个品系的果蝇进行杂交。表达shmiRNA,应该是一个发夹结构的RNA.后面的步骤就和进行RNAi的步骤是一样的。

下面是朱玉贤的现代分子生物学这本书中的图(考研的时候背的):

image.png

最终把PPO2基因敲低。



有几个非常好的视频,能帮助我理解,不过是YouTube上的。

https://www.youtube.com/watch?v=dPHitr3e51w

https://www.youtube.com/watch?v=QYNmd_I4iys

https://www.youtube.com/watch?v=rZIIZyX_vDI



youtue是个好东西。


今天虽然花了很长时间,但还是蛮高兴的。解决了一个问题。



http://blog.sciencenet.cn/blog-1076451-1179019.html

上一篇:[转载]PhiC31定点插入转基因

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